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1器材和方法

1.1材料佛手CitrusmedicaL.var.sarcodactylis(Noot.)Swingle(CMS)的葉片，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室張丹雁教授鑒定。樣品來源見表1。

1.2儀器與試劑Beckman-15CSR冷凍高速離心機(jī)；PCR儀(AppliedBiosystems2720Thermalcycler)；UVPGDS7600型凝膠成像儀；ECANSpectraFLUORplus多功能酶標(biāo)儀。大連寶生物DR001AMPCR擴(kuò)增試劑盒；上海生工隨機(jī)引物；上海生工進(jìn)口分裝瓊脂糖；上海申能博彩3s柱離心式植物基因組DNA試劑盒；天為時(shí)代DNAMarker(200bpDNALadderplus)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

表1樣品來源（略）

1.3方法

1.3.1佛手總DNA的提取和檢測(cè)采用上海申能博彩公司的3s柱離心式植物基因組DNA試劑盒提取。將提取到的DNA用純水稀釋10倍后，用酶標(biāo)儀分別測(cè)定其在260，280nm處的吸收值，計(jì)算出OD260與OD280的比值及DNA濃度，并以1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察提取結(jié)果的優(yōu)劣。

1.3.2佛手RAPD反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序在對(duì)佛手PCR擴(kuò)增體系優(yōu)化后，確定反應(yīng)的總體積為25μl，包括：MgCl22μl(25mmol/L)，引物1.5μl(10μmol/L)，dNTPs2μl（2mmol/L），10×buffer緩沖液3μl，0.3μlTaq酶（5U/μl），60ngDNA樣品。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min，94℃變性1min,35℃退火lmin,72℃延伸1.5min，40次循環(huán)，最后72℃延伸10min，－20℃保存。

1.3.3引物篩選選取德慶、青衣童子兩種地理位置差異較大的DNA樣品做模板，用110個(gè)引物(S1～S100,S220～S229)對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選。

1.3.4擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測(cè)13個(gè)佛手DNA樣品作為擴(kuò)增模板，用篩選的引物及條件進(jìn)行RAPD反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳、染色后在凝膠分子成像儀上檢測(cè)并拍照記錄。

1.3.5數(shù)據(jù)分析將電泳圖譜上清晰且可重復(fù)出現(xiàn)的條帶記為“1”，同一位置沒有出現(xiàn)條帶的記為“0”，從而生成由“1”和“0”組成RAPD表型數(shù)據(jù)矩陣。統(tǒng)計(jì)每條引物擴(kuò)增出的總帶數(shù)和多態(tài)性帶數(shù)，計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)百分率p=(k/n)×100%（其中k是多態(tài)位點(diǎn)數(shù)目；n為所測(cè)位點(diǎn)總數(shù)）。利用NTSYSpc-2.10e求出Nei-Li相似系數(shù)矩陣，用UPGMA法對(duì)其進(jìn)行聚類分析。

2結(jié)果

2.1引物篩選110個(gè)引物中有51條引物擴(kuò)增出條帶，每條引物擴(kuò)增帶數(shù)1～15條，平均6條，擴(kuò)增的譜帶分子量大小在300～2200bp，16條引物擴(kuò)增的多態(tài)性帶相對(duì)較多，且條帶清晰、重復(fù)性好。

2.2擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析以16個(gè)10mer引物對(duì)供試的13份材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。16個(gè)引物共擴(kuò)增出185條帶，其中多態(tài)性帶有168條，占90.8%；平均每個(gè)引物可擴(kuò)增出11.6條帶，平均每份材料可擴(kuò)增出14.2條帶，擴(kuò)增的譜帶分子量大小在300～2200bp；各個(gè)引物間擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)相差較大，不同引物的擴(kuò)增帶數(shù)變幅從6～15條不等，其中擴(kuò)增帶數(shù)最多的引物為S23，具15條擴(kuò)增帶，最少的為引物S6，僅具6條擴(kuò)增帶，說明不同引物與供試材料總基因組DNA部分區(qū)域的同源性具有較大的差異。部分引物的擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

表216個(gè)引物的擴(kuò)增結(jié)果（略）

2.3聚類分析13份供試材料的Nei遺傳相似系數(shù)矩陣如表3所示，經(jīng)聚類分析構(gòu)建親緣關(guān)系樹狀圖（圖2）。相似系數(shù)分布在0.58～0.89之間，說明佛手種質(zhì)的遺傳多樣性較為豐富。供試材料在相似系數(shù)為0.67處分為3個(gè)類群，第1類群包括Sn1，Sn2，Sn3和Sn4，第2類群包括Sn5，Sn6，Sn7和Sn8，第3類群包括Sn9，Sn10，Sn11，Sn12和Sn13。

表313份佛手種質(zhì)資源的相似系數(shù)矩陣（略）

圖中對(duì)應(yīng)的各個(gè)泳道的品種順序相同，從左到右依次為Sn1～Sn8，DNAMarker(200bpDNALadderplus)，Sn9～Sn13，陰性對(duì)照

圖1引物S24，S31，S80，S220的RAPD擴(kuò)增圖譜（略）

3討論

本研究應(yīng)用RAPD技術(shù)對(duì)佛手種間親緣關(guān)系進(jìn)行了闡明，來源不同的13份種質(zhì)的遺傳多樣性高達(dá)90.8%，表明佛手現(xiàn)有的種質(zhì)遺傳變異較大，從而構(gòu)成了較為豐富的種質(zhì)資源基因庫，說明佛手遺傳基礎(chǔ)廣，具有較大的育種潛力和較強(qiáng)的進(jìn)化能力，這與佛手栽培歷史悠久和種植范圍較廣有關(guān)。

圖2基于RAPD分析產(chǎn)生的佛手種質(zhì)資源聚類圖（略）

供試材料在相似系數(shù)為0.67處分為3個(gè)類群，這與按照產(chǎn)地的不同將佛手分為廣佛手、浙佛手和川佛手的劃分一致。第1類群和第3類群中各種質(zhì)之間的親緣較近，這與它們?cè)谥参飳W(xué)形態(tài)上差異不大的情況相吻合。第2類群中4個(gè)栽培品種雖然在植物學(xué)形態(tài)上差異較大，但由于生長(zhǎng)環(huán)境相同，在相似系數(shù)0.75處聚為一類，親緣關(guān)系也較近，可能是遺傳基因和環(huán)境相互作用的結(jié)果；其中，Sn8為Sn5的芽變選育品種，兩者在形態(tài)上有較大的差異，但分子水平上證明其遺傳關(guān)系較近；Sn6和Sn7兩者在葉片、花、果等植物學(xué)形態(tài)上差異較大，但其相似系數(shù)為0.78，表明其親緣關(guān)系較近，形態(tài)上的差異并未在分子水平上反映。第3類群中，Sn9（瀘州開手果）與Sn10（瀘州拳手果）代表佛手的兩種不同果型，以前通常按果型將佛手分為兩種農(nóng)家品種，但筆者在實(shí)地調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，目前開手與拳手果型的分化不明顯，同一樹上經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)兩種果型，而且春果一般為開手型，夏果一般為拳手型，表明佛手在長(zhǎng)期的自然演化中，果型已出現(xiàn)了混雜，果型的差異并不能說明其遺傳距離的遠(yuǎn)近。