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第1篇

一、醫(yī)學(xué)類大學(xué)生社會(huì)實(shí)踐與志愿服務(wù)工作的內(nèi)容和模式分析

（一）醫(yī)學(xué)類大學(xué)生社會(huì)實(shí)踐與志愿服務(wù)工作的內(nèi)容

社會(huì)實(shí)踐與志愿服務(wù)工作主要是根據(jù)學(xué)生所學(xué)醫(yī)學(xué)專業(yè)的特點(diǎn)，為醫(yī)院患者或者社區(qū)群眾開展衛(wèi)生宣傳教育和衛(wèi)生診療服務(wù)等，從而提高學(xué)生將自身的專業(yè)知識(shí)運(yùn)用到實(shí)踐的能力，以便為社會(huì)和群眾提供更多的服務(wù)。社會(huì)實(shí)踐與志愿服務(wù)工作的內(nèi)容主要為圍繞醫(yī)學(xué)知識(shí)宣講和醫(yī)療服務(wù)等方面開展。

（二）醫(yī)學(xué)類大學(xué)生社會(huì)實(shí)踐與志愿服務(wù)工作的模式

1.參觀教育模式。學(xué)校組織醫(yī)學(xué)生到一些大型的醫(yī)院中進(jìn)行參觀，主要包括醫(yī)生的診治過程、手術(shù)過程等觀察，讓醫(yī)學(xué)生充分認(rèn)識(shí)到醫(yī)療工作的重要性，切實(shí)提高廣大醫(yī)學(xué)生的敬業(yè)精神。

2.服務(wù)奉獻(xiàn)模式。組織廣大醫(yī)學(xué)生深入敬老院、福利院、孤兒院、兒童聾啞學(xué)校等社會(huì)福利組織中，為這些人群開展各項(xiàng)醫(yī)療和衛(wèi)生服務(wù)工作，從而幫助他們切身感受到這些特殊人群生活的疾苦，不斷提高醫(yī)學(xué)生的道德素養(yǎng)。

3.專題調(diào)研模式。在導(dǎo)師的帶領(lǐng)下，將醫(yī)學(xué)生劃分成若干專題研究小組，主要進(jìn)行對(duì)醫(yī)學(xué)的研討和社會(huì)調(diào)查活動(dòng)等等，主要是為了培養(yǎng)廣大醫(yī)學(xué)生社會(huì)認(rèn)知能力和科學(xué)研究能力[1]。4.其他模式。醫(yī)學(xué)類大學(xué)生開展社會(huì)實(shí)踐與志愿服務(wù)的模式還包括送藥、送醫(yī)以及送衛(wèi)生知識(shí)下鄉(xiāng)等。

二、醫(yī)學(xué)類大學(xué)生社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)工作模式存在的問題

（一）社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)工作模式單一

當(dāng)前醫(yī)學(xué)類大學(xué)生社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)工作模式相對(duì)單一，主要是以下兩個(gè)原因：一是個(gè)別學(xué)生參與社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)的積極性不高；二是個(gè)別醫(yī)學(xué)院還不能充分意識(shí)到社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)工作的重要性，并缺乏針對(duì)社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)考核體系，不能在醫(yī)學(xué)生中產(chǎn)生較大的教育意義。

（二）社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)脫離實(shí)際

從當(dāng)前個(gè)別醫(yī)學(xué)院開展的社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)工作來看，很多都是根據(jù)教學(xué)課程安排的需要，缺乏將社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)跟實(shí)際有效結(jié)合起來。

（三）社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)專業(yè)性不強(qiáng)

個(gè)別醫(yī)學(xué)院的組織者在開展社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)過程中不能有效將活動(dòng)內(nèi)容跟學(xué)生的專業(yè)、社會(huì)熱點(diǎn)的話題充分結(jié)合起來。

三、提高醫(yī)學(xué)類大學(xué)生社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)區(qū)的效果的重要途徑

（一）加強(qiáng)社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)的宣傳工作

作為醫(yī)學(xué)院，要充分利用社會(huì)媒體加強(qiáng)對(duì)醫(yī)學(xué)生社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)的宣傳力度，從而幫助社會(huì)及時(shí)了解醫(yī)學(xué)生參與社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)的重要性，進(jìn)一步為學(xué)生參與社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)創(chuàng)造良好的氛圍。另外，醫(yī)學(xué)院還應(yīng)該充分利用自身的校園網(wǎng)、宣傳欄、廣播等宣傳在社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)表現(xiàn)突出的團(tuán)體和個(gè)人，從而充分調(diào)動(dòng)學(xué)生參與社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)的積極性和熱情。

（二）豐富社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)的模式

由于低年級(jí)的醫(yī)學(xué)生自身的專業(yè)知識(shí)有限，業(yè)余時(shí)間少，學(xué)校在組織這部分學(xué)生參與社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)時(shí)應(yīng)該進(jìn)一步創(chuàng)新社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)的模式，在充分整合社會(huì)和校園的各方資源的基礎(chǔ)上，為其創(chuàng)造一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的醫(yī)學(xué)生實(shí)踐基地，并建立起具有醫(yī)學(xué)生社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)特色的創(chuàng)新機(jī)制，充分培養(yǎng)醫(yī)學(xué)生的組織、協(xié)調(diào)以及溝通能力[2]。

（三）加強(qiáng)社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)制度建設(shè)

組織廣大醫(yī)學(xué)類大學(xué)生參與社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)不但可以幫其深入基層、了解社會(huì)，還可以提高他們的專業(yè)知識(shí)。因此醫(yī)學(xué)院應(yīng)該進(jìn)一步加強(qiáng)醫(yī)學(xué)類大學(xué)生社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)工作的制度建設(shè)，爭(zhēng)取從動(dòng)員——申報(bào)立項(xiàng)——時(shí)間團(tuán)隊(duì)資料審批——實(shí)踐團(tuán)長安全教育整個(gè)過程能夠得到有效的監(jiān)督和指導(dǎo)，提高醫(yī)學(xué)生社會(huì)實(shí)踐和志愿服務(wù)工作的效果。

總結(jié)

第2篇

ExpressionandbiologicalactivityofmouseWnt3ageneinNIH3T3cells

【Abstract】AIM:ToexpressrecombinantmouseWnt3asignalproteinwithbiologicalactivity.METHODS:Therecombinanteukaryoticexpressionplasmid,pSecTag2/HygroBWnt3a,wastransfectedintoNIH3T3cellsbyliposome,thentheexpressedproteinwasdetectedbyWesternBlot.ThesaturationdensityandthecapabilityofsuppressingapoptosisinWnt3a/NIH3T3cellswereevaluated.RESULTS:TheWnt3asignalproteinwasstablyexpressedinWnt3a/NIH3T3cells.ThesaturationdensityandthecapabilityofsuppressingapoptosisinWnt3a/NIH3T3cellsweremarkedlyincreased.CONCLOUSION:WesuccessfullyconstructtherecombinantWnt3asignalproteinwithbiologicalactivity.

【Keywords】Wnt3a;eukaryoticexpression;contactinhibition;apoptosis

【摘要】目的：表達(dá)具備生物活性的重組小鼠Wnt3a信號(hào)蛋白.方法：應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將重組真核表達(dá)載體pSecTag2/HygroBWnt3a轉(zhuǎn)染并篩選穩(wěn)定表達(dá)的NIH3T3細(xì)胞，WesternBlot鑒定重組Wnt3a蛋白的表達(dá)，并對(duì)Wnt3a/NIH3T3細(xì)胞的融合密度及抗凋亡能力給予檢測(cè).結(jié)果：Wnt3a信號(hào)蛋白在Wnt3a/NIH3T3細(xì)胞中獲得穩(wěn)定表達(dá)，Wnt3a信號(hào)蛋白能夠明顯提高NIH3T3細(xì)胞的融合密度及抗凋亡能力.結(jié)論：在NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)的重組Wnt3a信號(hào)蛋白具備生物活性.

【關(guān)鍵詞】Wnt3a；真核表達(dá)；接觸抑制；細(xì)胞凋亡

0引言

小鼠Wnt3a基因是Wnt基因家族中的重要成員，其編碼表達(dá)Wnt3a信號(hào)蛋白.Wnt3a信號(hào)蛋白可以激活經(jīng)典的Wnt/βcatenin信號(hào)通路.Wnt3a信號(hào)蛋白對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的促神經(jīng)元分化的作用.我們應(yīng)用基因重組的方法，從小鼠胚腦中克隆Wnt3acDNA，構(gòu)建真核表達(dá)載體，通過陽離子脂質(zhì)體試劑將目的基因?qū)隢IH3T3細(xì)胞中，建立穩(wěn)定表達(dá)Wnt3a信號(hào)蛋白的NIH3T3細(xì)胞株，并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行初步分析.

1材料和方法

1.1材料真核表達(dá)載體pSecTag2/HygroBWnt3a由本研究室構(gòu)建.NIH3T3細(xì)胞株由安徽醫(yī)科大學(xué)病理教研室吳強(qiáng)教授惠贈(zèng).多聚賴氨酸購自博士德公司；胎牛血清及DMEM購自Gibco公司.潮霉素及LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、購自Invitrogen公司.質(zhì)粒小量提取試劑盒WizardPlusSVMiniprepsDNAPurificationsystem,ReverseTranscriptionSystemRTPCR試劑盒購自Promega公司；鼠抗mycmAb、鼠抗βcateninmAb購自SantaCruz公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗鼠二抗、TRITC標(biāo)記的兔抗鼠二抗購自北京中山公司；臺(tái)盼藍(lán)購自sigma公司.其他試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純.

1.2方法

1.2.1NIH3T3細(xì)胞的培養(yǎng)將凍存的NIH3T3細(xì)胞復(fù)蘇后用含100g/L的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃50mL/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3d換液1次,傳代3至4次使細(xì)胞達(dá)到良好的生長狀態(tài).

1.2.2NIH3T3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染按LipofectamineTM2000試劑說明書操作進(jìn)行.轉(zhuǎn)染前24h用胰蛋白酶消化貼壁的NIH3T3細(xì)胞，再以無血清及無雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸，并按1×105的細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，當(dāng)細(xì)胞生長至85%～90%融合度時(shí)，取純化的重組質(zhì)粒pSecTag2/HygroBWnt3a2μg，溶于250μL無血清的DMEM培養(yǎng)基中，得到A液.取3μLLipofectamineTM2000加于97μL無血清的DMEM培養(yǎng)基中，得到B液.將A,B液混勻，室溫放置30min后加入0.8mL含100g/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，均勻滴加于經(jīng)無血清培養(yǎng)基洗滌的貼壁細(xì)胞表面，于37℃50mL/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h.棄去轉(zhuǎn)染液，加2mL完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng).轉(zhuǎn)染后48h，待細(xì)胞生長至接近融合時(shí)收集上清，并按1∶3的密度傳代.繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)50%～70%.棄去培養(yǎng)液，更換濃度為600mg/L的潮霉素培養(yǎng)液進(jìn)行篩選.轉(zhuǎn)染時(shí)，設(shè)置轉(zhuǎn)染空載體pSecTag2/HygroB的組和正常細(xì)胞陰性對(duì)照組.約14d后，可見有陽性克隆形成，繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng).穩(wěn)定表達(dá)Wnt3a蛋白的細(xì)胞株命名為Wnt3a/NIH3T3（W/3T3），轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株命名為empty/NIH3T3（E/3T3），正常細(xì)胞陰性對(duì)照組命名為control/NIH3T3（C/3T3）.

1.2.3重組Wnt3a蛋白鑒定轉(zhuǎn)染48h后，分別收集C/3T3,E/3T3和W/3T3細(xì)胞各約1×106及其培養(yǎng)上清液.以SDS煮沸法裂解細(xì)胞并收集上清，并將其與細(xì)胞培養(yǎng)上清液真空冷凍干燥，濃縮至1/2體積，以鼠抗mycmAb為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗，使用WesternBlot方法行重組Wnt3a蛋白的鑒定.

1.2.4βcatenin的表達(dá)鑒定分別在轉(zhuǎn)染后6,12,24h收集W/3T3,E/3T3及C/3T3細(xì)胞各約1×106，以SDS煮沸法裂解細(xì)胞并收集上清，以鼠抗βcateninmAb為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗，使用WesternBlot方法進(jìn)行鑒定.

1.2.5Wnt3a/NIH3T3細(xì)胞增殖特性的鑒定以密度約1×105接種W/3T3,E/3T3及C/3T3細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板，隔日觀察，臺(tái)盼藍(lán)染色并使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞.

1.2.6Wnt3a/NIH3T3細(xì)胞抗凋亡實(shí)驗(yàn)以密度約1×105接種W/3T3,E/3T3及C/3T3細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板，24h后臺(tái)盼藍(lán)染色并使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，同時(shí)更換含10g/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，定時(shí)觀察并臺(tái)盼藍(lán)染色并使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞，計(jì)算存活細(xì)胞與原始細(xì)胞數(shù)的比值.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析.

2結(jié)果

2.1重組Wnt3a蛋白在的NIH3T3細(xì)胞中獲得表達(dá)WesternBlot鑒定發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3a基因的NIH3T3細(xì)胞裂解液中有一Mr約為45×103的特異性條帶，在轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3a基因的NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)上清液、E/3T3及C/3T3細(xì)胞裂解液和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，均未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)條帶(圖1).

1:W/3T3組細(xì)胞裂解液；2：W/3T3組細(xì)胞培養(yǎng)上清液；3：E/3T3組細(xì)胞裂解液；4：C/3T3組細(xì)胞裂解液.

圖1WestemBlot鑒定Wnt3a信號(hào)蛋白的表達(dá)（略）

2.2Wnt3a/NIH3T3細(xì)胞中βcatenin的表達(dá)上調(diào)對(duì)Wnt信號(hào)通路中的重要信息分子βcatenin的表達(dá)情況進(jìn)行WesternBlot鑒定，在Mr約90×103處出現(xiàn)特異性條帶(圖2)，但無時(shí)間依賴性.

1~3:培養(yǎng)6,12,24h.

圖2各實(shí)驗(yàn)組βcatenin表達(dá)（略）

2.3Wnt3a/NIH3T3細(xì)胞融合密度明顯增高經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，以密度約1×105接種的E/3T3及C/3T3細(xì)胞3d后生長至融合密度，此時(shí)細(xì)胞融合密度約4.6×105，但W/3T3細(xì)胞繼續(xù)生長至第6d，細(xì)胞融合密度約13×105，與另外兩組相比，W/3T3細(xì)胞融合密度明顯增高（P<0.01）(圖3，4).

A：W/3T3；B：E/3T3；C：C/3T3.

圖3各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞融合密度觀察(倒置×100)（略）

2.4W/3T3細(xì)胞抗凋亡能力明顯增高經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，更換含10g/L胎牛血清的培養(yǎng)液48h后，E/3T3及C/3T3細(xì)胞大量凋亡，細(xì)胞數(shù)明顯減少，但W/3T3細(xì)胞數(shù)無明顯減少，抗凋亡能力明顯提高（P<0.01）(圖5，6).

圖4實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)變化（略）

A：W/3T3；B：E/3T3；C：C/3T3.

圖5各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞抗凋亡能力觀察(倒置×100)（略）

圖6實(shí)驗(yàn)組存活細(xì)胞比例（略）

3討論

Wnt信號(hào)蛋白為含有23～24個(gè)保守型半胱氨酸殘基,在人類的基因組中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Wnt基因19種［1-2］.Wnt3a是Wnt基因家族的重要成員，其基因早在1992年就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，而且多種的真核細(xì)胞被用于它的表達(dá)，但由于其低溶解度及疏水性等特點(diǎn)，一直未能純化出具備生物活性的Wnt3a信號(hào)蛋白.1998年，Shibamoto等［3］使用L細(xì)胞（鼠胸腺激酶缺陷細(xì)胞株；LMTK）作為表達(dá)細(xì)胞時(shí)，在培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)了大量具備生物活性的Wnt3a蛋白，約400μg/L.Willert等［4］所純化的Wnt3a信號(hào)蛋白通過激活Wnt信號(hào)通路促使骨髓中的造血干細(xì)胞分裂和自我復(fù)制，認(rèn)為Wnt可能在一系列組織的自我更新中起信號(hào)作用.

βcatenin是經(jīng)典的Wnt/βcatenin信號(hào)通路中重要的信息分子［5］，其在Wnt信號(hào)通路關(guān)閉的情況下，βcatenin被磷酸化而迅速降解.Wnt信號(hào)通路被激活后，βcatenin在胞內(nèi)大量聚集，并進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng).βcatenin表達(dá)的明顯上調(diào)代表Wnt信號(hào)通路被激活.實(shí)驗(yàn)中WesternBlot鑒定發(fā)現(xiàn)βcatenin表達(dá)明顯上調(diào)，但沒有發(fā)現(xiàn)與時(shí)間有依賴關(guān)系.實(shí)驗(yàn)中表達(dá)的重組Wnt3a信號(hào)蛋白帶有myc標(biāo)簽，Burrus等［6］認(rèn)為如果Wnt3a信號(hào)蛋白帶有標(biāo)簽將影響其活性，甚至失活.但同樣有文獻(xiàn)［7,8］中應(yīng)用的Wnt3a信號(hào)蛋白帶有myc,HA等標(biāo)簽，而且文獻(xiàn)中對(duì)其活性同樣做了詳細(xì)的描述.本實(shí)驗(yàn)夠構(gòu)建的重組Wnt3a信號(hào)蛋白具備生物學(xué)活性，但未能與野生型（wildtype）Wnt3a信號(hào)蛋白活性做詳細(xì)的比較，其生物學(xué)活性的變化有待進(jìn)一步分析.

Wnt3a蛋白可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化.在使用含有Wnt3a信號(hào)蛋白的條件培養(yǎng)液培養(yǎng)E11.5d的胎鼠前腦神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細(xì)胞大量分化成為MAP2陽性的神經(jīng)元.去除Wnt3a信號(hào)蛋白后，神經(jīng)干細(xì)胞恢復(fù)增殖能力，而且當(dāng)條件培養(yǎng)液中的FGF2去除后，分化的神經(jīng)元形態(tài)更為成熟［8-9］.來源于小鼠大腦皮質(zhì)的神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)基因后超表達(dá)Wnt信號(hào)蛋白，即使在培養(yǎng)液中加入FGF2，依然大量向神經(jīng)元分化，但阻斷Wnt信號(hào)通路后神經(jīng)元的分化被抑制［10］.

Wnt信號(hào)通路的生物學(xué)作用十分復(fù)雜，不同的Wnt基因，不同的細(xì)胞，甚至不同的細(xì)胞狀態(tài)都有可能產(chǎn)生不同的作用［11］.在本實(shí)驗(yàn)中我們采用pSecTag2/HygroBWnt3a真核表達(dá)載體，NIH3T3細(xì)胞作為表達(dá)細(xì)胞，成功表達(dá)重組Wnt3a信號(hào)蛋白，初步探討了Wnt3a信號(hào)蛋白的生物學(xué)活性，為進(jìn)一步建立用于以治療為目的的分子移植的方法奠定基礎(chǔ).

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第3篇

EffectsofoctylphenoloncellcycleandcyclinexpressionofMDAMB231breastcancercells

【Abstract】AIM:Toobservetheeffectsofoctylphenol(OP)oncellcycleandcyclinexpressionofMDAMB231breastcancercellsandtoprobethemolecularmechanismsofOPinhibitingMDAMB231breastcancercellproliferation.METHODS:Thechangesofcellproliferation,cellcycle,cyclinD1mRNA,cyclinD3mRNA,CDK2mRNA,CDK4mRNAandcyclinD1proteinexpressionsofMDAMB231cellstreatedwithOPwereobservedbyusingMTTtest,flowcytometry,immunocytochemistryandRTPCR.RESULTS:WhenMDAMB231breastcancercellsweretreatedwith4or8μmol/LOPfor48h,thecellinhibitionrateswere(17.13±4.1)%,(40.25±8.7)%,andthefluorescencevaluesofcyclinD1were55.1±10.2,41.4±11.2,significantlydecreasedascomparedwithcontrolgroup(89.9±11.2,P<0.05).WhenMDAMB231breastcancercellsweretreatedwith8μmol/LOPfor24and72h,thecellratiosintheG0/G1phasewere(67.0±17.6)%and(44.4±11.9)%，significantlyincreasedascomparedwithcontrolgroup［(46.6±12.8)%at24h,(15.3±3.1)%at72h,P<0.05］.OPinhibitedthemRNAexpressionsofcyclinD1,cyclinD3,CDK2andCDK4andtheproteinexpressionofcyclinD1.CONCLUSION：OPcaninhibittheproliferationofMDAMB231breastcancercells,whichmayberelatedtodownregulatingtheexpressionsofcyclinD1,cyclinD3,CDK2andCDK4mRNAandcyclinD1protein.

【Keywords】cellproliferation;breastneoplasms;octylphenol;cyclinD1；cylindependentkinases

【摘要】目的:觀察辛基酚(OP)對(duì)細(xì)胞周期及周期蛋白表達(dá)的影響，探討OP抑制MDAMB231乳腺癌細(xì)胞增殖的可能分子機(jī)制.方法：以MTT試驗(yàn)、流式細(xì)胞分析、免疫細(xì)胞化學(xué)和RTPCR等方法觀察OP對(duì)MDAMB231乳腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、CDK2，CDK4，cyclinD1和cyclinD3表達(dá)的影響.結(jié)果：4,8μmol/LOP作用MDAMB231乳腺癌細(xì)胞48h時(shí)，其抑制率為(17.1±4.1)%,(40.3±8.7)%，cyclinD1表達(dá)量熒光值為55.1±10.2，41.4±11.2，比對(duì)照組(89.9±11.2)明顯降低(P<0.05).8μmol/LOP作用MDAMB231乳腺癌細(xì)胞24h和72h，G0/G1期細(xì)胞為(67.0±17.6)%和(44.4±11.9)%，G0/G1期細(xì)胞比對(duì)照組［24h，(46.6±12.8)%；72h，(15.3±3.1)%］明顯增高(P<0.05).OP導(dǎo)致MDAMB231乳腺癌細(xì)胞中CDK2，CDK4，cyclinD1和cyclinD3mRNA的表達(dá)降低，且cyclinD1蛋白的表達(dá)也降低.結(jié)論：OP能抑制MDAMB231乳腺癌細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與OP能降低乳腺癌細(xì)胞中CDK2，CDK4，cyclinD1和cyclinD3mRNA及其蛋白的表達(dá)有關(guān).

【關(guān)鍵詞】細(xì)胞增殖;乳腺癌;辛基酚；細(xì)胞周期蛋白D1;細(xì)胞周期蛋白質(zhì)依賴激酶類

0引言

辛基酚（octylphenols,OP）是一種環(huán)境雌激素，近年來對(duì)它的雌激素活性檢測(cè)及其生殖毒性效應(yīng)研究較多［1］.OP能促進(jìn)ERα+MCF7乳腺癌細(xì)胞的增殖，表現(xiàn)雌激素活性，卻抑制ERα-MDAMB231乳腺癌細(xì)胞的增殖［2］.細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期密切相關(guān)，本研究將OP作用于MDAMB231乳腺癌細(xì)胞，觀察細(xì)胞的增殖和CDK2,CDK4,cyclinD1，cyclinD3表達(dá)的改變，探討OP影響MDAMB231乳腺癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制.

1材料和方法

1.1材料試劑中，OP純度>98%，sigma產(chǎn)品.cyclinD1抗體為兔抗人抗體，使用濃度為1∶75倍稀釋，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗兔抗體，北京中杉產(chǎn)品.RTPCR試劑盒，上海sangon產(chǎn)品.二甲亞砜(DMSO)，純度>98%，進(jìn)口分裝試劑，用于配制OP.MDAMB231乳腺癌細(xì)胞由中科院上海細(xì)胞所提供.實(shí)驗(yàn)前將MDAMB231乳腺癌細(xì)胞在無酚紅的DMEM/F12中培養(yǎng)24h以耗盡細(xì)胞的內(nèi)源性雌激素，然后以該培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)分為3組：對(duì)照組，給予DMSO；4μmol/LOP組；8μmol/LOP組.

1.2方法

1.2.1MTT試驗(yàn)以492nm波長測(cè)定活細(xì)胞的吸光度（A），抑制率（PR）=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100%，每次試驗(yàn)設(shè)2個(gè)平行孔，試驗(yàn)重復(fù)3次［3］.

1.2.2細(xì)胞周期相及凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞處理24,48和72h，收獲細(xì)胞，700mL/L冷乙醇固定，RNase消化，碘化丙啶(PI)染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每次試驗(yàn)設(shè)2個(gè)平行孔，試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.3cyclinD1表達(dá)分析細(xì)胞生長于小蓋玻片上，多聚甲醛固定，血清封閉，加一抗于37℃孵育50min，加熒光素標(biāo)記二抗孵育20min，甘油封片，LeicaNT激光共聚焦顯微鏡觀察、照相及數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次.計(jì)算熒光強(qiáng)度時(shí)每組實(shí)驗(yàn)取3張片子，每張片子取36個(gè)視野，每個(gè)視野取5個(gè)細(xì)胞，計(jì)算其平均熒光強(qiáng)度.

1.2.4RTPCR檢測(cè)CDK2,CDK4,cyclinD1,cyclinD3的mRNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞處理24h，收獲細(xì)胞，用Trizol試劑一步法提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置-80℃?zhèn)溆?引物由上海sangon合成，CDK2：F5′GCTCTCACTGGCATTCCTCCT3′，R5′5′CGAAATGAAGGCACTAGAGC3′，產(chǎn)物546bp；CDK4：F5′CTACCTCTCGATATGAGCCAGT3′，R5′CATCTGGTAGCTGTAGATTCTG3′，產(chǎn)物563bp；cyclinD1：F5′GAGGAACAGAAGTGCGAGGA3′，R5′TCTGGAGAGGAAGCGTGTGA3′，產(chǎn)物501bp；cyclinD3：F5′TGTCAGGAGCAGATCGAAGC3′，R5′CCTTTAGAAGGCACTAGAGC3′，產(chǎn)物453bp；βactin：F5′AGGGGCCGGACTCGTCATACT3′，R5′GGCGGCACCACCATGTACCCT3′，產(chǎn)物202bp.25μL體系加樣本總cDNA，上游和下游引物各1.5μL，依次加入試劑盒其他成分.反應(yīng)條件為94℃滅活40s，60℃或61℃退火40s，72℃延伸40s，22個(gè)循環(huán)，20g/L瓊脂糖電泳，照相，半定量分析以凝膠成像系統(tǒng)的分析軟件Q1來分析其灰度值，每實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以目的條帶/βactin之比值為結(jié)果，各組間進(jìn)行單因素方差分析.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)用x±s表示，組間比較用SPSS10.0軟件進(jìn)行單因素方差分析.

2結(jié)果

2.1MDAMB231乳腺癌細(xì)胞增殖以4,8μmol/LOP作用MDAMB231乳腺癌細(xì)胞48h，細(xì)胞抑制率為(17.1±4.1)%，(40.3±8.7)%.

2.2MDAMB231乳腺癌細(xì)胞周期相分布8μmol/LOP作用MDAMB231乳腺癌細(xì)胞24h和72h，G0/G1期細(xì)胞分別為(67.0±17.6)%和(44.4±11.9)%，G0/G1期細(xì)胞比對(duì)照組［24h，(46.6±12.8)%；72h，(15.3±3.1)%］明顯增高(P<0.05).

2.3MDAMB231乳腺癌細(xì)胞中cyclinD1蛋白表達(dá)cyclinD1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞的胞漿中(圖1)，4,8μmol/LOP組cyclinD1表達(dá)量熒光值分別為55.1±10.2，41.4±11.2，比對(duì)照組(89.9±11.2)明顯降低(P<0.05).

A：對(duì)照組；B：4μmol/LOP組；C：μmol/LOP.

圖1OP對(duì)MDAMB231乳腺癌細(xì)胞中cyclinD1表達(dá)的影響SPFITC×400（略）

2.4MDAMB231乳腺癌細(xì)胞中CDK2,CDK4,cyclinD1,cyclinD3mRNA表達(dá)mRNA的表達(dá)以電泳條帶的亮度來判斷，亮度值越強(qiáng)，mRNA量越高，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)軟件處理，與對(duì)照組比較，OP組CDK2,CDK4,cyclinD1及cyclinD3mRNA表達(dá)均降低(圖2).

M:marker;1:8μmol/LOP;2:4μmol/LOP;3:對(duì)照.aP<0.05vs對(duì)照.

圖2OP對(duì)MDAMB231乳腺癌細(xì)胞中cyclinD3,cyclinD1,CDK2,CDK4mRNA表達(dá)的影響（略）

3討論

雌激素是哺乳動(dòng)物體內(nèi)分泌的一種性激素，起著調(diào)節(jié)動(dòng)物生長、分化和生殖的作用.OP是一種苯環(huán)類化合物，能與ERα結(jié)合，顯示出雌激素活性.OP主要用于生產(chǎn)非離子表面活性劑、增塑劑、熱穩(wěn)定劑、光穩(wěn)定劑等，廣泛存在于生活、工作環(huán)境的水體、淤泥、土壤和食物如魚類、貝類及飲用水中［4］.MDAMB231乳腺癌細(xì)胞是一株ERα-的細(xì)胞，>15μmol/LOP對(duì)MCF7乳腺癌細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生毒性作用，1~10μmol/LOP會(huì)對(duì)MDAMB231乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)，抑制MDAMB231乳腺癌細(xì)胞的增殖［1］.以植物雌激素三羥異黃酮作用184B5/HER細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞數(shù)量減少，呈劑量效應(yīng)關(guān)系，同時(shí)G0/G1期細(xì)胞增高，細(xì)胞凋亡也增多.本研究結(jié)果顯示4，8μmol/LOP均能抑制MDAMB231乳腺癌細(xì)胞增殖，并呈時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng).

細(xì)胞增殖依賴于細(xì)胞周期的順利進(jìn)行，該過程受G1/S，G2/M兩個(gè)關(guān)健點(diǎn)調(diào)控.植物雌激素三羥異黃酮能將MDAMB231乳腺癌細(xì)胞阻滯于G2/M期，細(xì)胞凋亡增加［5］，超二倍體增加.本研究結(jié)果顯示OP作用MDAMB231乳腺癌細(xì)胞24h，G0/G1期細(xì)胞(凋亡峰)明顯增加(P<0.05)，表明OP具有急性毒性作用，細(xì)胞迅速凋亡.OP引起MDAMB231乳腺癌細(xì)胞周期阻滯與三羥異黃酮不同，這可能與三羥異黃酮具有多種生物活性有關(guān).

細(xì)胞增殖依賴于細(xì)胞周期的順利進(jìn)行，細(xì)胞周期的正常進(jìn)行又依賴于細(xì)胞周期調(diào)控蛋白如cyclinD，cyclinA，cyclinE等及細(xì)胞周期依賴性激酶(CDK)的正常表達(dá).cyclinDCDK4是G0/G1期的限速步驟，過度表達(dá)G1期的周期蛋白如cyclinD，cyclinE能加速細(xì)胞快速通過G1期.cyclinD1蛋白表達(dá)與細(xì)胞周期運(yùn)行有關(guān)［6］，抑制腫瘤組織生長與P53的高表達(dá)及cyclinD1低表達(dá)相關(guān)［7］.以17羥雌二醇作用雌性Wistar大鼠60d，發(fā)現(xiàn)雌二醇通過減少CDK2，CDK4的表達(dá)以及降低CDK2活性，將細(xì)胞阻滯于G1/S期［8］.本研究結(jié)果表明，OP作用MDAMB231乳腺癌細(xì)胞后，能降低CDK2,CDK4,cyclinD1及cyclinD3mRNA的表達(dá)，降低cyclinD1蛋白的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，細(xì)胞阻滯于G1/S期，導(dǎo)致MDAMB231乳腺癌細(xì)胞的增殖受抑，并呈劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng).

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