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《中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)》2014年第四期

1高通量測(cè)序技術(shù)在大豆功能基因組學(xué)中的應(yīng)用

高通量測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于大豆種質(zhì)資源分析和基因資源挖掘中，涉及的技術(shù)領(lǐng)域包括基因組重測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組分析、miRNA鑒定等，對(duì)深入研究大豆功能基因組學(xué)發(fā)揮了巨大作用。基因組重測(cè)序技術(shù)已成為研究大豆基因組遺傳變異規(guī)律的有效方法之一。Li等采用該技術(shù)對(duì)野生大豆和栽培大豆的進(jìn)化選擇過(guò)程進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：在從野生大豆向栽培大豆的演變過(guò)程中，人工選擇發(fā)揮了很大作用，其表現(xiàn)之一是降低了大豆的遺傳多樣性。該研究所提供的基因資源和信息也將促進(jìn)大豆重要農(nóng)藝性狀相關(guān)的基因挖掘。Wong等利用RNASeq技術(shù)對(duì)大豆成花誘導(dǎo)過(guò)程中葉片和頂端分生組織轉(zhuǎn)錄組的變化進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素等植物激素代謝調(diào)控途徑與成花啟動(dòng)具有密切關(guān)系。在抗逆性研究方面，Ali等利用Tag測(cè)序技術(shù)比較了耐鹽型野生材料STGoGS和鹽敏感型栽培品種SSGoGM在鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄組變化，發(fā)現(xiàn)大豆可通過(guò)ABA合成、基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)響應(yīng)鹽脅迫；Le等通過(guò)研究干旱脅迫下大豆葉片轉(zhuǎn)錄組的變化，發(fā)現(xiàn)了大量抗旱相關(guān)基因；Vidal等通過(guò)比較兩個(gè)抗旱性迥異品種的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)了一些抗旱多態(tài)性位點(diǎn)。這些研究結(jié)果表明，高通量轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)可有效地應(yīng)用于大豆新基因發(fā)現(xiàn)和新分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)。高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用還大大加快了miRNA的發(fā)現(xiàn)過(guò)程。Wang等通過(guò)高通量測(cè)序詳細(xì)地分析了大豆低氮反應(yīng)中miRNA的相互調(diào)控關(guān)系。Shamimuzzaman等對(duì)大豆種子發(fā)育過(guò)程中由miRNA介導(dǎo)的剪切降解片段進(jìn)行深度測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了53個(gè)miRNA，并初步確定了其所作用的180個(gè)靶基因。隨著測(cè)序成本的降低和海量數(shù)據(jù)處理能力的加強(qiáng)，高通量測(cè)序技術(shù)將會(huì)被更多地應(yīng)用到大豆基因組學(xué)研究中，為大豆新基因的挖掘和分子育種帶來(lái)革命性的變革。

2大豆新基因發(fā)掘進(jìn)展

近年來(lái)，大豆生長(zhǎng)發(fā)育分子機(jī)制研究取得了顯著成績(jī)。Xia等發(fā)現(xiàn)E1編碼一個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子，其與GmFT2a和GmFT5a的表達(dá)呈現(xiàn)拮抗關(guān)系，抑制植株開(kāi)花。Jiang等發(fā)現(xiàn)GmFT2a的啟動(dòng)子區(qū)域存在多態(tài)性，但這種多態(tài)性與生育期多樣性關(guān)系不大，認(rèn)為大豆品種的生育期分化主要與GmFT2a的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。Na等［12］克隆了大豆中的GmSOC1like基因，基因表達(dá)分析和百脈根遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證明該基因是大豆中的開(kāi)花誘導(dǎo)基因。Luo等發(fā)現(xiàn)一年生野大豆（Glycinesoja）中的WRKY家族基因GsWRKY20可能通過(guò)調(diào)節(jié)開(kāi)花相關(guān)基因（FLC、FT、SOC1、CO）的表達(dá)正向調(diào)控開(kāi)花。Zhao等發(fā)現(xiàn)大豆中編碼GAMYB結(jié)合蛋白的基因GmGBP1與開(kāi)花有關(guān)。在長(zhǎng)日照條件下，該基因在擬南芥中異位表達(dá)能夠通過(guò)光周期途徑和赤霉素途徑改變CO、FT、LEAFY和GAMYB的表達(dá)促進(jìn)開(kāi)花，而在短日照條件下，GmGBP1則通過(guò)自主途徑改變FLC和SVP的表達(dá)進(jìn)而抑制開(kāi)花；同時(shí)，GmGBP1還能夠增強(qiáng)植株的耐熱性和耐旱性，降低耐鹽性。D1和D2是STAYGREEN（SGR）在大豆中的同源基因，它們的表達(dá)促進(jìn)葉綠素的降解和細(xì)胞程序性凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，上述基因的突變是造成大豆成熟時(shí)葉片持綠和種皮綠色的原因［15］。Meng等［16］發(fā)現(xiàn)大豆中的藍(lán)光受體CRY2a能夠與轉(zhuǎn)錄因子ClB1相互作用抑制衰老相關(guān)基因（例如WRKY53b）的表達(dá)從而延緩葉片衰老。在結(jié)瘤研究方面，Radwan等［17］發(fā)現(xiàn)1433蛋白SGF14c和SGF14l在大豆結(jié)瘤前期有重要的作用。Qin等［18］分離了一個(gè)與根瘤高親和的磷轉(zhuǎn)運(yùn)基因GmPT5，其編碼的蛋白能將磷從根的維管束系統(tǒng)運(yùn)輸?shù)礁?，尤其是在磷有限的條件下，GmPT5對(duì)大豆結(jié)瘤和根瘤生長(zhǎng)有重要的調(diào)控作用。在農(nóng)藝性狀相關(guān)研究方面，Jeong等克隆了大豆葉型和莢粒數(shù)控制基因Ln，該基因是擬南芥JAGGED（JAG）的同源基因，參與葉型的控制和果實(shí)的發(fā)育，與大豆莢粒的形成有關(guān)，該研究為大豆高產(chǎn)育種提供了有價(jià)值的基因資源。在大豆抗病性研究方面，Liu等和Cook等分別克隆了大豆抗胞囊線蟲(chóng)基因Rhg4和Rhg1。Rhg4編碼一個(gè)絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶，參與植物體內(nèi)葉酸的代謝。Rhg1位點(diǎn)由3個(gè)抗性相關(guān)基因組成，Rhg1基因拷貝數(shù)的增加導(dǎo)致基因表達(dá)量升高，從而使大豆獲得對(duì)胞囊線蟲(chóng)的抗性。在大豆抗逆性研究方面，Luo等發(fā)現(xiàn)來(lái)自一年生野大豆的GsWRKY20基因在擬南芥中的異位表達(dá)大大增加了植株的抗旱性。Xu等從大豆中分離了12個(gè)分子伴侶GmHsp90基因，這些基因在葉片中表達(dá)，并且會(huì)受到高溫、高滲透壓和鹽脅迫的強(qiáng)烈激活，而對(duì)冷脅迫不敏感。此外，研究人員從栽培大豆和野生大豆中分離到的GmDREB2A；2、JAZ家族基因GsJAZ22和GsZFP12基因都與非生物脅迫反應(yīng)相關(guān)。

3大豆分子標(biāo)記輔助選擇研究進(jìn)展

近年來(lái)，在分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用方面更加注重利用新的連鎖分析方法挖掘與重要性狀相關(guān)的位點(diǎn)，為更好地了解大豆遺傳機(jī)制和新基因的克隆奠定基礎(chǔ)。Ha等利用KeunolkongxSinpaldalkong重組自交系研究了種子表皮破裂性狀在4個(gè)環(huán)境下的QTL及其環(huán)境效應(yīng)。Yang等利用東農(nóng)594和Charleston雜交形成的重組自交系研究11種環(huán)境條件下控制大豆籽粒性狀QTL的加性與上位性作用，確定了主效QTL和不同效應(yīng)的QTL，為更好地進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇提供了基礎(chǔ)。以往的研究已定位了多個(gè)性狀的QTL位點(diǎn)，但真正應(yīng)用于育種實(shí)踐的卻很少，主要是因?yàn)镼TL位點(diǎn)定位多采用一個(gè)群體，所定位的QTL位點(diǎn)易受遺傳背景影響，所以近年的研究嘗試用多群體、染色體片段置換系（chromosomesegmentsubstitutionlines，CSSL）群體和回交群體等，以期找到不受群體背景影響的位點(diǎn)。Pathan等利用公共親本Magellan分別與PI438489B和PI567516C雜交，構(gòu)建了包含216和156株系的重組自交系，發(fā)現(xiàn)7個(gè)與蛋白含量相關(guān)的位點(diǎn)、6個(gè)與油分含量相關(guān)的位點(diǎn)和4個(gè)與產(chǎn)量相關(guān)的位點(diǎn)，其中位于第6號(hào)染色體上的位點(diǎn)還與種子百粒重相關(guān)。關(guān)聯(lián)分析的發(fā)展為有效發(fā)現(xiàn)、評(píng)價(jià)和利用分子標(biāo)記提供了強(qiáng)有力的工具。在開(kāi)花期相關(guān)位點(diǎn)的研究方面，Zuo等利用118個(gè)SSR標(biāo)記來(lái)分析了兩年試驗(yàn)中275個(gè)大豆品種的光溫敏感性，得到一系列與光溫反應(yīng)相關(guān)的位點(diǎn)。Niu等利用來(lái)自中國(guó)6個(gè)生態(tài)區(qū)的257個(gè)品種來(lái)分析與大豆籽粒形狀相關(guān)的性狀，找到了一些有價(jià)值的變異位點(diǎn)。Korir等以分別來(lái)自中國(guó)黃河和長(zhǎng)江流域的188個(gè)品種和184個(gè)KFNo．1xNN11382重組自交系為材料，對(duì)大豆的耐鋁性遺傳機(jī)制進(jìn)行研究，用連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析兩種方法共同定位到了11個(gè)位點(diǎn)，其中Satt209、Sat＿364、Sat＿240、Sct＿190和Satt284標(biāo)記在以往的研究中也被證明與耐鋁性相關(guān)。兩種方法共同定位的標(biāo)記很有可能位于耐鋁性基因的候選區(qū)域。隨著功能基因的挖掘、分子標(biāo)記的增加和檢測(cè)效率的提高，分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)正向自動(dòng)化方向發(fā)展。Song等在測(cè)序基礎(chǔ)上發(fā)展了含有高密度SNPs的大豆基因芯片SoySNP50KiSelectSNPBeadchip，為分子標(biāo)記在大豆遺傳多樣性分析和高通量連鎖圖譜構(gòu)建等方面的應(yīng)用提供了強(qiáng)有力的工具。目前，基因芯片技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于大豆抗蚜性，蛋白質(zhì)和脂肪含量等方面的研究。一些生物技術(shù)公司已實(shí)現(xiàn)大豆分子標(biāo)記技術(shù)的高度自動(dòng)化，將其廣泛應(yīng)用于雜交后代篩選和品種純度檢驗(yàn)。結(jié)合測(cè)序的分子標(biāo)記技術(shù)為全基因組功能標(biāo)記、非功能標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及品種全基因組檔案建立奠定了基礎(chǔ)。

4大豆轉(zhuǎn)基因育種研究進(jìn)展

目前，商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因大豆品種除具有耐除草劑的特性外，還出現(xiàn)疊加高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病等新性狀的材料。過(guò)去兩年中，大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)也得到進(jìn)一步優(yōu)化，轉(zhuǎn)化效率不斷提高。

4．1大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化是大豆轉(zhuǎn)基因育種中應(yīng)用最早和最廣泛的方法。該方法對(duì)目的基因分子量大小和外植體種類的限制小，導(dǎo)入基因的拷貝數(shù)低，外源基因整合完整，遺傳穩(wěn)定，表達(dá)效果好。早在1988年，Hinchee等就用這種方法得到了大豆轉(zhuǎn)基因植株，證明該方法在大豆遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用的可行性。然而，由于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)化效率受到農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化侵染能力、大豆基因型、組織培養(yǎng)條件、TDNA轉(zhuǎn)移效率和轉(zhuǎn)化后篩選模式等因素的影響，目前轉(zhuǎn)化效率仍然不高。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直在進(jìn)行對(duì)該方法的改進(jìn)和優(yōu)化工作。Song等從20種中國(guó)大豆品種中篩選到了3個(gè)轉(zhuǎn)化效率較穩(wěn)定的大豆品種粵春045、粵春033和天隆1號(hào)。郝榮華等從13個(gè)大豆品種中篩選出適合子葉節(jié)轉(zhuǎn)化的山寧14，優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化效率可到3．2％。蓋江南等［39］利用大豆幼胚進(jìn)行不定胚誘導(dǎo)進(jìn)而建立了大豆懸浮培養(yǎng)不定胚繁殖體系用于基因槍轉(zhuǎn)化。另外，李永光等建立了一種新型農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆不定胚原位誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，通過(guò)去除萌發(fā)大豆的頂芽及側(cè)芽，輕劃傷口后滴入菌液進(jìn)行侵染，通過(guò)不定芽分化最終得到抗性植株。應(yīng)用于大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系的傳統(tǒng)篩選劑有卡那霉素、潮霉素和草胺膦等，近期也有一些關(guān)于其他篩選劑報(bào)道。岳巖磊等和張敏等分別探索了草甘膦和滅草煙的篩選效果，認(rèn)為這兩種篩選劑也具有較好的應(yīng)用前景，從而拓寬了篩選劑的選擇空間。

4．2大豆轉(zhuǎn)基因品種選育轉(zhuǎn)基因技術(shù)在改良大豆品質(zhì)、耐除草劑、抗病性、抗逆性等方面取得了新的進(jìn)展。美國(guó)孟山都公司推出的高油酸大豆，其油酸含量比目前任何商業(yè)化種植的大豆品種都要高。此外，抗麥草畏、高產(chǎn)、抗蟲(chóng)高產(chǎn)、高Ω3亞麻酸、高γ亞麻酸（GLA）、高油等類型的轉(zhuǎn)基因品種已經(jīng)或即將上市。在抗病蟲(chóng)大豆新材料創(chuàng)制方面，Youssef等發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)AtPAD4（PHYTOALEXINDEFICIENT4）的大豆復(fù)合體植株對(duì)大豆胞囊線蟲(chóng)（soybeancystnematode，SCN）及根節(jié)線蟲(chóng)（rootknotnematode，RKN）的抗性均有所提高；在導(dǎo)入水楊酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因GmSAMT1的大豆發(fā)狀根以及導(dǎo)入大豆胞囊線蟲(chóng)果糖1，2磷酸酶沉默載體pRAPHgALDRNAi的大豆復(fù)合體植株［45］中，SCN的發(fā)育受到阻礙；過(guò)表達(dá)抗蟲(chóng)基因cryIA的大豆品種東農(nóng)50對(duì)食心蟲(chóng)的抗性明顯優(yōu)于對(duì)照。在抗逆育種研究方面，轉(zhuǎn)入水稻脫水應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子OsDREB2A和過(guò)表達(dá)GmNFR5a的轉(zhuǎn)基因大豆耐鹽性有所提高；轉(zhuǎn)入煙草滲調(diào)蛋白基因Tbosm的大豆植株不僅耐鹽性有所改善，而且對(duì)白粉菌、褐紋病菌和大豆銹菌的抗性也有所增強(qiáng)；過(guò)表達(dá)鹽芥肌醇磷酸激酶基因ThIPK2的大豆在耐旱、耐鹽以及抗氧化能力方面均有所提高。在品質(zhì)改良方面，Song等將擬南芥胱硫醚γ合成酶基因AtDCGS轉(zhuǎn)入大豆，提高了籽粒蛋氨酸的含量；Kim等將O乙酰絲氨酸巰解酶基因OASS轉(zhuǎn)入大豆，提高了籽粒中與蛋白質(zhì)結(jié)合的半胱氨酸和游離半胱氨酸的含量。以上研究為培育抗病、抗逆、優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)基因大豆品種奠定了基礎(chǔ)。2013年，中國(guó)農(nóng)業(yè)部為巴斯夫農(nóng)化有限公司申請(qǐng)的抗除草劑大豆CV127、孟山都遠(yuǎn)東有限公司申請(qǐng)的抗蟲(chóng)大豆MON87701和抗蟲(chóng)耐除草劑大豆MON87701×MON89788發(fā)放了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書(shū)，允許其進(jìn)口用作加工原料。其中，CV127已在美國(guó)、加拿大、日本、韓國(guó)、澳大利亞、新西蘭、菲律賓、墨西哥、哥倫比亞、俄羅斯、南非、巴西和阿根廷等國(guó)家獲得批準(zhǔn)用于商業(yè)化種植或食用；MON87701已在美國(guó)、加拿大、日本、歐盟和墨西哥等國(guó)家或地區(qū)批準(zhǔn)用于商業(yè)化種植或食用；MON87701×MON89788已在歐盟、韓國(guó)、墨西哥、阿根廷、巴西和巴拉圭等國(guó)家或批準(zhǔn)用于商業(yè)化種植或食用?？梢?jiàn)，轉(zhuǎn)基因大豆新品種的商業(yè)化種植及應(yīng)用已成為全球化的發(fā)展趨勢(shì)，因此提高我國(guó)轉(zhuǎn)基因大豆自主研發(fā)能力已刻不容緩［54］。

5展望

2012－2013年，國(guó)內(nèi)外大豆分子育種取得了較大進(jìn)展，并呈現(xiàn)出新的發(fā)展趨勢(shì)，今后應(yīng)更加注重以下領(lǐng)域的研究：高通量測(cè)序技術(shù)在大豆種質(zhì)資源分析和基因資源挖掘方面的應(yīng)用；具有重要利用價(jià)值的基因的挖掘；關(guān)聯(lián)分析方法在基因定位方面的作用；多時(shí)期、多環(huán)境、多遺傳背景條件下大豆重要性狀QTL的挖掘；復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因大豆品種的培育。與水稻、玉米等作物相比，目前大豆的基因組學(xué)研究相對(duì)滯后，具有實(shí)用價(jià)值的分子標(biāo)記較少，遺傳轉(zhuǎn)化效率偏低，限制了大豆分子育種工作的發(fā)展。今后，需要進(jìn)一步加強(qiáng)大豆功能基因組學(xué)研究，深入解析重要經(jīng)濟(jì)性狀形成的分子機(jī)制，挖掘有育種價(jià)值的新基因和分子標(biāo)記，進(jìn)一步提高大豆分子標(biāo)記輔助育種的通用性、自動(dòng)化水平和轉(zhuǎn)基因育種的效率，實(shí)現(xiàn)分子育種與常規(guī)育種的有機(jī)結(jié)合。作為世界上最大的轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)口國(guó)，我國(guó)應(yīng)該大力加強(qiáng)大豆分子生物學(xué)研究，推進(jìn)生物技術(shù)在大豆育種中應(yīng)用，提高自主研發(fā)能力，早日實(shí)現(xiàn)生物技術(shù)改良品種的生產(chǎn)應(yīng)用。

作者：曲夢(mèng)楠蔣炳軍劉薇毛婷婷馬立明林抗雪韓天富單位：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所