本站小編為你精心準(zhǔn)備了森林微生物DNA提取研究參考范文，愿這些范文能點(diǎn)燃您思維的火花，激發(fā)您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

作者：年士政單位：安徽省懷遠(yuǎn)師范學(xué)校懷遠(yuǎn)

在森林生態(tài)系統(tǒng)中,人們往往只注意到樹木及其林下植被,而對(duì)林下土壤中的微生物認(rèn)識(shí)很少。誠(chéng)然,與參天大樹相比,微生物的的確確微不足道,然而,微生物在森林生態(tài)系統(tǒng)中的功能性作用是任何人都不能忽視的。森林是微生物天然活動(dòng)和繁衍的重要場(chǎng)所,微生物依賴植物而生存,同時(shí)微生物對(duì)森林乃至整個(gè)生態(tài)環(huán)境都有著重要的作用。試想,假如森林中沒(méi)有腐生型微生物,森林中的枯枝落葉將不能分解,地球也將成為一個(gè)大垃圾庫(kù);假如森林中沒(méi)有共生型微生物,營(yíng)共生生活的植物物種將無(wú)法正常生長(zhǎng),許多植物將會(huì)從地球上消失;缺少微生物,森林生態(tài)系統(tǒng)中的營(yíng)養(yǎng)循環(huán)和能量循環(huán)就無(wú)法實(shí)現(xiàn)。當(dāng)然,在森林生態(tài)系統(tǒng)脆弱條件下,微生物也會(huì)給森林帶來(lái)災(zāi)害,如流行性病害。隨著人們對(duì)森林微生物的研究和認(rèn)識(shí)的不斷加深,許多新的研究方法和技術(shù)也相繼得到了發(fā)展和應(yīng)用。本文對(duì)dna分析技術(shù)在森林微生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用和研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,希望對(duì)廣大林業(yè)工作者有所啟發(fā)。

1森林微生物DNA分析技術(shù)

1.1DNA技術(shù)概述

DNA分析技術(shù)是在一系列分子技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的,其中PCR(PolymeraseChainReaction)、RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)、RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)、AFLP(AmplifiedRestrictionFragmentPolymorphism)等技術(shù)是分子生物學(xué)技術(shù)的核心。以PCR技術(shù)(即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))為例,這一DNA分析技術(shù)是20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來(lái)的一種快速體外基因擴(kuò)增技術(shù)[1],原理是用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DN段,在DNA聚合酶催化作用及引物存在條件下,連續(xù)進(jìn)行高溫變性、低溫退火、中溫DNA合成這一循環(huán)。

1.2森林微生物DNA分析技術(shù)

在森林中,與參天大樹相比,微生物顯得非常渺小。由于微生物的/微觀0特征,使得林業(yè)工作者們?cè)谘芯可治⑸飼r(shí)困難重重,尤其是對(duì)微生物資源的分類鑒定,因此在一定程度上阻礙了人們對(duì)微生物在森林生態(tài)系統(tǒng)中的功能性作用的了解和進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。借助DNA分析技術(shù),無(wú)疑有助于鑒定和從量化角度去研究這些微觀生命體。下面以森林真菌DNA分析技術(shù)為例,討論森林微生物DNA的提取、純化和分析方法。

1.2.1DNA的提取高等真菌DNA的提取,通?？梢圆捎米訉?shí)體/子囊果、孢子、擔(dān)孢子或菌絲體等作為起始材料,DNA的提取可以直接從細(xì)胞的破碎開始。但由于從林地里采取的樣品中,可能會(huì)混雜有植物材料,因此在進(jìn)行DNA提取時(shí)要清除污染DNA,同時(shí),還要考慮土壤及其它化合物的污染。鑒于真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特性,用于植物DNA的提取方法,需要根據(jù)情況做必要的修改和補(bǔ)充,才能取得較好的分離效果。真菌組織細(xì)胞和菌絲體細(xì)胞的破碎,通常采用液氮或干冰研磨。SDS(十二烷基硫酸鈉)細(xì)胞壁裂解技術(shù)是常用的方法之一,在擔(dān)子菌和子囊菌DNA的提取上十分有效[2]。另外,與植物DNA提取不同,對(duì)森林微生物細(xì)胞壁的破碎和DNA提取,通常不加細(xì)胞壁裂解酶,以避免目的DNA的降解;提取緩沖液中的EDTA濃度不宜過(guò)高,否則可能會(huì)影響核酸的活性。

1.2.2DNA的純化根據(jù)真菌類型和DNA分析的要求不同,對(duì)DNA需要進(jìn)一步純化。DNA純化通常采用酚、酚氯、氯仿等溶劑反復(fù)抽提,以降解并除去蛋白質(zhì)雜質(zhì)。也可采用CsCl密度梯度超速離心法。CsCl密度梯度超速離心是根據(jù)各分離物質(zhì)密度的不同而達(dá)到分離的目的。分離蛋白質(zhì)的CsCl密度大約為1.2g#ml-1,RNA密度較大,約為1.8g#ml-1,DNA約在1.5~1.7g#ml-1,同時(shí)還依賴于嵌入DNA中的溴化乙錠(EB)的量。較理想的CsCl終濃度在1.57~1.62g#ml-1。除此以外,還可采用蛋白酶K消化蛋白質(zhì)雜質(zhì),或加入核糖核酸酶RNase消化除去RNA雜質(zhì)。許多與樹木共生的真菌,如豆馬勃(Pisolithusspp.)、樁菇(Pax-illusspp.)等擔(dān)子菌,多含有較高濃度的醛類物質(zhì),因此對(duì)這類微生物DNA的純化需要特別小心。

1.2.3DNA的分析對(duì)微生物DNA分析之前,首先要對(duì)DNA含量和純度進(jìn)行評(píng)價(jià)。常用的評(píng)價(jià)方法有紫外分光光度法、熒光檢測(cè)法和EB染色法。瓊脂糖凝膠電泳法是微生物DNA分離鑒定和DNA純化的常用方法。這一技術(shù)可分離出其它方法無(wú)法分離的DN段,而且分離的片段范圍較廣,不同濃度的瓊脂糖凝膠可分離出長(zhǎng)度在200pb~50kb的DN段。用EB染色便于在紫外燈下觀察,有利于特定DNA條帶的回收。目前一般實(shí)驗(yàn)室多采用水平板式凝膠電泳裝置。瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì),凝膠的密度取決于瓊脂糖的濃度。采用RFLP技術(shù)進(jìn)行森林微生物DNA分析,是對(duì)含有特殊序列的DN段進(jìn)行比較分析的常用手段。鑒于RFLP是對(duì)不同大小的DN段進(jìn)行分析,因而對(duì)于帶有不同的核酸序列卻具有相近大小的DN段,用電泳的方法是不易區(qū)分開的,而DNA雜交技術(shù)可以顯著提高靈敏度。

1.2.4DNA雜交技術(shù)在對(duì)森林微生物進(jìn)行菌種鑒定,研究菌種個(gè)體間或其他分類水平上的親緣關(guān)系,或進(jìn)行環(huán)境檢測(cè)時(shí),都要借助DNA雜交技術(shù)。DNA雜交是ssDNA分子間具有高度同源性的核苷酸序列間的結(jié)合。探針序列被標(biāo)記,以用來(lái)檢測(cè)其與目的DNA結(jié)合的情況。采用35S或32P標(biāo)記探針,經(jīng)放射自顯影技術(shù)可以對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行觀察和研究。在反應(yīng)條件和探針選擇方面,要考慮到雜交條件的限制性及探針的選擇問(wèn)題。

2DNA技術(shù)在森林微生物研究中的應(yīng)用

2.1森林微生物的分類鑒定

由于森林微生物一般形體較小,結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單,傳統(tǒng)分類學(xué)方法僅依賴于形態(tài)結(jié)構(gòu)的描述,已很難保證分類的準(zhǔn)確性和科學(xué)性,因而借助現(xiàn)代分子生物學(xué)手段可大大提高微生物的分類鑒定水平。在對(duì)森林微生物進(jìn)行DNA分析時(shí),需要根據(jù)微生物DNA結(jié)構(gòu)的相似性和特異性,合成特異探針或引物。合成探針或引物的模板,可以是rRNA序列、染色體總DNA、rRNA基因的全部或非保守片段,甚至可以是rRNA基因保守區(qū)域及那些編碼蛋白質(zhì)、木質(zhì)素酶、纖維素酶或色素產(chǎn)物的基因。研究者們對(duì)多種植物和微生物的rDNA進(jìn)行了測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)ITS和IGS片段具有較高的穩(wěn)定性,菌物學(xué)家Gardes和Bruns等以ITS片段為模板,合成了多種引物(表1)[3],其中ITS1-F對(duì)真菌類特異性較高,可用于從混雜的植物或其它微生物類群的基因中將真菌區(qū)分開來(lái),而ITS4-B對(duì)真菌中的擔(dān)子菌有很好的特異性。Erland等(1994)[4]采用引物CNL12(5p-CTGAACGCCTCTAAGTCAG-3p)和5SA(5p-CAGAGTCCTATGGC-CGTGGAT-3p)對(duì)外生菌根真菌TylosporafibrilloseDonk的rDNA進(jìn)行了RFLP分析,該菌與其它外生菌根真菌具有顯著不同的RFLPs圖譜,因此可用于菌種的分離與鑒定。

2.2森林微生物多態(tài)性及親緣關(guān)系的研究

在研究微生物親緣關(guān)系時(shí),通常用到DAN雜交技術(shù)。DNA雜交技術(shù)是建立在核酸堿基互補(bǔ)配對(duì)這一基本特性之上的。近些年來(lái),在森林微生物研究中應(yīng)用DNA分析技術(shù),已取得顯著進(jìn)展,尤其在森林病原菌和林木共生菌(包括固氮細(xì)菌和菌根真菌)方面成績(jī)斐然。Ry-giewicz等(1994)[2]研究了共生真菌DNA的提取和分析方法,使這一技術(shù)更趨成熟。Arm-strong等(1989)[5]從真菌子實(shí)體中提取DNA,然后采用限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)DNA進(jìn)行酶切,得到的產(chǎn)物用于DNA的雜交研究,以揭示菌種間的親緣關(guān)系。Cummings等(1990)應(yīng)用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)技術(shù),對(duì)叢枝菌根真菌的遺傳關(guān)系進(jìn)行了研究;Henrion等(1992)[6]對(duì)4種蠟?zāi)⒕?Laccariabicolor、L.laccata、L.proxime、L.tortilis)的26個(gè)菌株的DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,揭示出這些菌株在種間和種內(nèi)存在多態(tài)性。研究發(fā)現(xiàn),森林中常見的擔(dān)子菌雙色蠟?zāi)?Laccariabicolor),經(jīng)過(guò)DNA提取和進(jìn)行RFLP分析,如果采用完整基因雜交,放射自顯影對(duì)RFLP的觀察結(jié)果應(yīng)與紫外觀察的一致;但如果用探針編碼一個(gè)從該菌中分離出來(lái)的特定基因,則在其染色體DNA的RFLP中通過(guò)放射自顯影僅能觀察到一條或幾條帶。在瑞典Karen等(1997)[7]通過(guò)對(duì)隸屬17屬的44種大型真菌rDNA的ITS區(qū)域進(jìn)行CfoI,HinfI和MboI消化和RFLP分析,對(duì)真菌種間遺傳多樣性做了比較;并對(duì)部分菌種ITS序列進(jìn)行了分析。Lobuglio等(1990)[8]對(duì)大型真菌土生空?qǐng)F(tuán)菌(CenococcumgeophilumFr.)71個(gè)菌株的種內(nèi)同源性及多樣性進(jìn)行了研究,種間相似性的變化范圍較大(100%到44%),表明該真菌可能具有廣泛的遺傳多樣性,同時(shí)也表明,該真菌的分類學(xué)地位尚有待深入細(xì)致的研究,例如,從分子生物學(xué)角度可能會(huì)分出幾個(gè)不同的種來(lái)。

2.3展望

作為一門交叉學(xué)科的森林微生物學(xué),在分別應(yīng)用林學(xué)和基礎(chǔ)微生物學(xué)研究方法的同時(shí),借助當(dāng)代分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行發(fā)展,將對(duì)森林微生物學(xué)研究帶來(lái)無(wú)限生機(jī)。目前,林業(yè)微生物科學(xué)工作者在許多方面開展了有益的探索,尤其是在森林微生物分類鑒定、功能基因序列測(cè)定等領(lǐng)域取得了一定的成就。我們相信,分子生物學(xué)這一新興技術(shù)的不斷發(fā)展及其在生物學(xué)各學(xué)科的廣泛應(yīng)用,對(duì)加深認(rèn)識(shí)森林微生物的功能與作用、開發(fā)和利用森林微生物、改善森林生態(tài)環(huán)境、造福人類有著重要的意義。