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1方法

1.1微生物菌粉的制作地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌均采用肉湯培養(yǎng)基（蛋白胨10g•L-1，牛肉膏5g•L-1，NaCl5g•L-1水1L，調(diào)節(jié)pH值7.0~7.2，121℃滅菌20min，冷卻備用）培養(yǎng)。從試管斜面上取一環(huán)菌苔，接種到10mL滅菌的肉湯液體培養(yǎng)基中，于30℃、100r•min-1搖床上培養(yǎng)24h，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，再將該菌液接入已滅菌的250mL肉湯培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)24～48h，當(dāng)活菌數(shù)>5×109CFU•mL-1時，將菌液按重量比1∶4的比例吸附于超細膨潤土粉上，低溫干燥后成為菌粉，活菌含量不低于109CFU•g-1。

1.2微生物菌及生物酶組合的篩選將養(yǎng)殖池塘的底泥取回實驗室，放入全自動控溫型養(yǎng)殖系統(tǒng)（內(nèi)含規(guī)格為100cm×60cm×50cm的玻璃水族箱32個）的水族箱中，鋪滿水族箱底部，泥層厚度為（8.0±0.3）cm。同時用池塘水將底泥蓋住，上覆水層厚度為（5.0±0.2）cm，DO為（4.2±0.3）mg•L-1，環(huán)境溫度為（28±0.5）℃。為防止試驗時水分的蒸發(fā)，每3d用池塘水補足上覆水深度。將微生物菌、生物酶單獨試驗，并進行不同的組合，設(shè)置了15個不同的處理組，詳見表1，同時設(shè)置不添加菌和酶的對照組。試驗設(shè)置2個平行，研究菌、酶及其復(fù)配物對底泥中有機碳的轉(zhuǎn)化情況，篩選最適宜的菌—酶組合底質(zhì)凈化劑。

1.3微生物菌及生物酶復(fù)配對養(yǎng)殖水體底泥的轉(zhuǎn)化及有機碳的影響根據(jù)1.2.2中所篩選出的最適菌酶組合，將其應(yīng)用于養(yǎng)殖生產(chǎn)池塘，探究其底質(zhì)凈化的能力。為保證菌酶制劑能順利抵達并停留在底質(zhì)層面，將菌酶組合壓制成直徑為3cm的片劑，每片的平均質(zhì)量為15g。試驗設(shè)置3個劑量組，用量為4.50,6.75,9.00kg•hm-2，同時設(shè)1個對照組。試驗設(shè)2個平行，分別在試驗開始后的0,15,30d，對不同劑量微生物菌—酶組合處理后的養(yǎng)殖池塘底泥進行取樣測試，了解養(yǎng)殖池塘底泥中有機碳的動態(tài)變化情況。同時進行水體底泥厚度的分析，了解水體底質(zhì)環(huán)境質(zhì)量的變動情況，以便尋求最佳的微生物菌酶處理方式。試驗期間底質(zhì)有機碳的分析方法采用HJ615—2011所規(guī)定的重鉻酸鉀氧化—分光光度法[9]，底泥厚度的測量采用下探尺法直接測量。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析試驗數(shù)據(jù)使用SPSS19.0軟件進行差異顯著性分析，P<0.05表明差異顯著，P<0.01表明差異極顯著。

2結(jié)果與分析

2.1不同菌酶組合對池塘底質(zhì)有機碳的轉(zhuǎn)化參考目前養(yǎng)殖底質(zhì)凈化劑的使用情況，試驗采用每個水族箱中添加30g菌粉、酶或菌酶組合的用量（相當(dāng)于0.625mg•cm-3泥的用量），應(yīng)用不同的菌、酶及其組合來處理養(yǎng)殖底泥，10d后測定底泥中有機碳的含量，了解微生物或酶及其組合對池塘底泥的轉(zhuǎn)化情況，具體情況見表1。由表1可見，在試驗期間，同樣使用0.625mg•cm-3的量處理池塘底泥，由于采用的處理物質(zhì)不同，10d后底泥中的總有機碳含量明顯不同，TOC的去除率相差較大。與對照組相比，無論是微生物單一菌種或單一酶，其在10d內(nèi)均對底泥的TOC有一定的去除作用，去除率在4.0%~7.4%。但微生物菌與菌組合或酶與酶的組合效果顯著好于單一微生物或酶，其對TOC的去除率為10.0%~15.9%。而微生物菌與生物酶的組合效果則更優(yōu)異，其不同組合對TOC的去除效果在10.5%~23.8%，特別是地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+淀粉酶+纖維素酶（按1∶1∶2∶1組合）的組合效果最佳，對底泥TOC的去除率高達23.8%。這主要與菌酶的不同性質(zhì)有密切關(guān)系。地衣芽孢桿菌是兼性細菌，好氧、微氧條件下均可生長，枯草芽孢桿菌是好氧細菌[10]，故其兩者組合具有在不同DO水平下的作用效果，并且比好氧條件下效果更好。本試驗中因底泥層較薄，上覆水較淺，DO相對較高，為（4.2±0.3）mg•L-1，故效果顯著。同時，由于養(yǎng)殖池塘底質(zhì)受飼料殘留影響較大，殘餌中碳水化合物（糖類）的含量高達62%[11]，故淀粉酶的效果較好。因本試驗是在底泥離開池塘的條件下開展的，僅針對微生物—酶的效果篩選，故尚需在池塘中進行驗證試驗。

2.2微生物菌粉及生物酶復(fù)配對養(yǎng)殖水體底泥的轉(zhuǎn)化及有機碳的影響采用地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+淀粉酶+纖維素酶（按1∶1∶2∶1比例）的組合，按4.50，6.75，9.00kg•hm-2的處理用量處理養(yǎng)殖水體中的底泥30d，每隔15d取樣分析養(yǎng)殖池塘底泥的厚度及有機碳TOC的含量，考察微生物—酶組合在控制養(yǎng)殖池塘底泥有機碳中的應(yīng)用效果。不同試驗組的池塘底質(zhì)環(huán)境情況見圖1和圖2。由圖1和圖2可見，將菌酶復(fù)合制劑按不同的用量加入養(yǎng)殖池塘后，隨著使用劑量的增加，水體底泥中的有機碳含量在下降，導(dǎo)致了底泥厚度的降低。其中4.50kg•hm-2試驗組的效果明顯不如另外2個試驗組，但6.75kg•hm-2和9.00kg•hm-2試驗組的效果并無顯著性差異。考慮到經(jīng)濟有效性，選擇菌酶制劑的用量以6.75kg•hm-2為宜。在溫度和DO適宜的條件下，6.75kg•hm-2試驗組經(jīng)30d的試驗，可降低池塘底泥厚度0.47cm，底泥中有機碳的去除率達21.82%，對控制池塘底泥的發(fā)生及碳素的釋放具有顯著的功效。微生物和酶的作用需要有一定的溫度和DO作保證，本試驗的水溫維持在28~31℃，底層水體的DO水平在3.2~3.8mg•L-1間，滿足了不同特性微生物的生長和酶的催化活性，故對底泥及TOC的控制效果較好。因本試驗是在養(yǎng)殖池塘中進行，無法隨意地控制DO，因此對限制微生物和酶作用效果的最低DO水平無法評估，需要在以后的研究中加以完善。

2.3菌酶復(fù)合制劑的經(jīng)濟效益分析為使本研究的研究成果具有推廣價值，故對使用菌酶復(fù)合制劑的經(jīng)濟效益進行分析和評估。上述試驗表明，用于處理池塘底泥污染的菌酶制劑的適宜用量為6.75kg•hm-2，30d內(nèi)具有較顯著的效果。如果每30d使用1次，1個養(yǎng)殖季節(jié)（以6個月計）1公頃水面的池塘用量為40.5kg。根據(jù)實際的比例，其中淀粉酶為16.2kg、纖維素酶8.1kg、地衣芽孢桿菌8.1kg、枯草芽孢桿菌8.1kg。其中的主要成本來自2個酶，淀粉酶的價格為每28元•kg-1，纖維素酶為35元•kg-1。而菌粉成本相對較低，僅為5元•kg-1。故菌酶復(fù)合制劑在一個養(yǎng)殖季節(jié)中的實際使用成本僅為825元•hm-2，遠低于目前的化學(xué)性底質(zhì)改良劑使用成本。試驗結(jié)果表明，利用菌酶復(fù)合制劑對集約化養(yǎng)殖池塘進行處理，可減少底泥的產(chǎn)生量，降低有機碳的含量，減少碳排放，具有良好的環(huán)境效益、經(jīng)濟效益和社會效益，有一定的推廣價值。

3結(jié)論

（1）采用0.625mg•cm-3的用量，應(yīng)用不同的菌酶組合處理養(yǎng)殖底泥，10d后測定底泥中有機碳的含量。與對照組相比，無論是微生物單一菌種或單一酶，其在10d內(nèi)均對底泥的TOC有一定的去除作用。但微生物和酶的組合效果顯著好于單一微生物或酶，其中地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+淀粉酶+纖維素酶（按1∶1∶2∶1比例）的組合效果最佳，對底泥TOC的去除率高達23.8%。（2）采用地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+淀粉酶+纖維素酶（按1∶1∶2∶1比例）的組合，按4.50，6.75，9.00kg•hm-2的處理用量處理養(yǎng)殖水體中的底泥30d，隨著使用劑量的增加，水體底泥中的有機碳含量在下降，導(dǎo)致了底泥厚度的降低。菌酶制劑的用量以6.75kg•hm-2為宜。在溫度和DO適宜的條件下，6.75kg•hm-2試驗組經(jīng)30d的試驗，可降低池塘底泥厚度0.47cm，與對照組相比TOC的去除率達21.82%，對控制池塘底泥的發(fā)生及碳素的釋放具有顯著的功效。（3）利用菌酶復(fù)合制劑對集約化養(yǎng)殖池塘進行處理，可減少底泥的產(chǎn)生量，降低有機碳的含量，減少碳排放，且菌酶復(fù)合制劑的實際使用成本僅為825元•hm-2，具有良好的環(huán)境效益、經(jīng)濟效益和社會效益，有一定的推廣價值。

作者：周建忠 吳偉 單位：南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 無錫漁業(yè)學(xué)院 蘇州市吳江區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 淡水漁業(yè)研究中心