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《中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)》2014年第七期

1間接ELISA的建立以及條件優(yōu)化

1．1采用方陣加樣法，對(duì)梯度稀釋的包被抗原、梯度稀釋的血清進(jìn)行間接ELISA，利用酶標(biāo)儀測(cè)定各微孔的D450，選定最適的抗原包被濃度和血清稀釋度。

1．2分別按照4℃過(guò)夜、37℃1h、37℃2h，進(jìn)行ELISA測(cè)定，每孔重復(fù)測(cè)定3次，選擇最佳包被條件。

1．3根據(jù)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，分別選擇0．1％、0．5％、1％的BSA，0．1％、0．5％、1％的脫脂奶粉作為封閉液封閉1h，選擇合適的封閉液種類和濃度。

1．4分別用以上得到的封閉液種類和濃度進(jìn)行封閉0．5、1、1．5h，選擇合適的封閉液時(shí)間。

1．5將兔抗豬IgG用稀釋液作1∶1000、1∶2000、1∶3000、1∶4000、1∶5000系列稀釋，選擇最佳工作濃度。

1．6將兔抗豬分別孵育0．5、1．5、2h，確定二抗的最佳孵育時(shí)間。

1．7計(jì)算間接ELISA檢測(cè)臨界值取30份PRRSV陰性血清按優(yōu)化條件，在選擇好的條件下進(jìn)行間接ELISA測(cè)定，求D450平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。臨界值＝x＋3×sx。

1．8特異性試驗(yàn)按優(yōu)化的間接ELISA操作步驟，用胸膜肺炎陽(yáng)性血清、豬圓環(huán)病毒病陽(yáng)性血清、豬偽狂犬陽(yáng)性血清、豬瘟陽(yáng)性血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，每份血清重復(fù)檢測(cè)4孔，同時(shí)PRRSV陰、陽(yáng)性血清（美洲型）各1份作對(duì)照組。通過(guò)D450來(lái)判定陰陽(yáng)性結(jié)果，以此來(lái)判定特異性。

1．9敏感性試驗(yàn)將陽(yáng)性和陰性血清從1000倍作二倍比稀釋，將P／N值＞2．0的最大血清稀釋度作為其靈敏度。進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)

1．10重組N蛋白包被板保存期的確定用同一批制備的N蛋白包被板條，并分為干板包被和濕板包被，按己建立的間接ELISA方法每周進(jìn)行檢測(cè)，PRRSV陰、陽(yáng)性血清每板分別重復(fù)5孔，結(jié)果取平均值。每周l次，共檢測(cè)6次。

將提純的N蛋白作為抗原，免疫6～8周齡BALB／c小鼠3只，共免疫4次，每次間隔2周。用間接ELISA檢測(cè)可用后去眼球放血處死小鼠，進(jìn)行細(xì)胞融合，篩選陽(yáng)性融合細(xì)胞并進(jìn)行亞克隆；挑選經(jīng)產(chǎn)BALB／c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟0．5mL／只。10～14d后，將篩選出的雜交瘤細(xì)胞注射至小鼠體內(nèi)。每只小鼠腹腔接種雜交瘤細(xì)胞（1～3）×106個(gè)。7～10d后，采集腹水。采用辛酸硫酸銨沉淀法對(duì)腹水進(jìn)行純化，并對(duì)單克隆抗體進(jìn)行效價(jià)、亞類和特異性的鑒定。

1．11膠體金試紙條條件選擇以及制備采用檸檬酸三鈉反應(yīng)法制備直徑約為20nm的膠體金顆粒。取10支EP管，每管加1mL制備好的膠體金溶液；用0．1mol／LK2CO3調(diào)節(jié)溶液的pH值：在1～10號(hào)管內(nèi)分別加入3、4、5、6、7、8、9、10、11、12μL的0．1mol／LK2CO3，混勻，室溫靜止10min；每管加入1g／L的8號(hào)抗體10μL，即每管加入抗體10μg，搖勻，室溫靜止10min；然后每管加入0．1mol／LNaOH50μL，搖勻，室溫靜止2h后觀察結(jié)果。溶液顏色沒(méi)有變化的即為膠體金的最適pH值。另取6支EP管，每管加入1mL制備好的膠體金溶液；用0．1mol／LK2CO3調(diào)節(jié)溶液至最適pH值，搖勻，室溫靜止10min；在1～6號(hào)管內(nèi)分別加入1g／L的8號(hào)抗體2、3、4、5、6和7μL，搖勻，室溫靜止10min；然后每管加入0．1mol／LNaOH50μL，搖勻，室溫靜止2h后觀察結(jié)果。以穩(wěn)定1mL膠體金溶液顏色不變的最低抗體量為該抗體的最低用量，在實(shí)際工作中，需增加10％～20％以確保溶液穩(wěn)定。按金標(biāo)抗體的制備流程標(biāo)金，隨后用金標(biāo)工作液將金標(biāo)McAb作1∶2、1∶4、1∶8、1∶10、1∶20稀釋，在玻璃纖維素膜上按每平方厘米鋪31μL的金標(biāo)抗體溶液進(jìn)行鋪金，其他條件不變，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

2結(jié)果

2．1N蛋白的純化和特異性

2．1．1N蛋白的純化用Elutionbuffer洗脫所得的流通液含目的蛋白量較大，可達(dá)到90％以上的純度，且雜蛋白量少，達(dá)到預(yù)期效果（圖1）。2．1．2純化后N蛋白的Westernblot將菌體全蛋白和純化后的N蛋白轉(zhuǎn)膜進(jìn)行之后的Westernblot檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2，在圖中看見(jiàn)在菌體全蛋白和純化后N蛋白液中均在17000處有明顯條帶，且純化后的N蛋白只有1條條帶，表明純化后的N蛋白特異性很好。

2．2間接ELISA各條件的優(yōu)化結(jié)果及性能測(cè)定

2．2．1優(yōu)化結(jié)果確定抗原包被濃度為1g／L、檢測(cè)血清稀釋倍比為1∶800、包被條件為4℃過(guò)夜、以1％的BSA作為封閉液、封閉條件為37℃，1h、37℃0．5h，2000倍稀釋作為兔抗豬IgG最佳工作條件。

2．2．2臨界值的確定按照間接ELISA基本的步驟，利用優(yōu)化條件進(jìn)行ELISA測(cè)定，對(duì)30份的已經(jīng)測(cè)定為陰性的血清進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)定。由數(shù)據(jù)計(jì)算可得：D450平均值＝0．213180104，標(biāo)準(zhǔn)差＝0．002223016臨界值＝0．219849當(dāng)測(cè)定樣品的D450值＞0．219849時(shí)，則樣品判定為陽(yáng)性；當(dāng)測(cè)定樣品的D450值＜0．219849時(shí)，樣品判定為陰性。

2．2．3特異性試驗(yàn)結(jié)果用上述建立好的ELISA方法檢測(cè)由石家莊市畜禽疫病防治站提供的胸膜肺炎陽(yáng)性血清、豬圓環(huán)病毒病陽(yáng)性血清、豬瘟陽(yáng)性血清、豬偽狂犬陽(yáng)性血清，每份血清重復(fù)檢測(cè)5孔，同時(shí)PRRSV陰、陽(yáng)性血清（美洲型）各取1份作為對(duì)照組，通過(guò)表1中D450值判定各抗原間不存在交叉反應(yīng)（表1）。

2．2．4敏感性測(cè)定結(jié)果將陽(yáng)性血清，陰性血清同時(shí)稀釋，從稀釋1000倍開(kāi)始做二倍比稀釋，至20000倍時(shí)，陽(yáng)性血清D450依然在0．5以上，S／P值大于2．1，而陰性值已經(jīng)趨于平衡并且數(shù)值很小，故沒(méi)做更大倍數(shù)的稀釋，只稀釋至20000倍。

2．2．5批內(nèi)的檢測(cè)試驗(yàn)用同一時(shí)間制備的N蛋白進(jìn)行包被，按上文優(yōu)化的條件來(lái)實(shí)施間接ELISA檢測(cè)，PRRSV陰、陽(yáng)性血清每板檢測(cè)分別做5復(fù)孔，重復(fù)檢測(cè)5次。結(jié)果取其平均值。在其他條件不變的情況下，根據(jù)表2中D450值，計(jì)算得到：批內(nèi)的變異系數(shù)結(jié)果為小于7％。說(shuō)明同一時(shí)間制備的N蛋白在ELISA的試驗(yàn)中變異的程度相對(duì)較小，重復(fù)性相對(duì)良好。

2．2．6批間的檢測(cè)試驗(yàn)用不同時(shí)間制備的N蛋白包被板條，按上文優(yōu)化的條件來(lái)實(shí)施間接ELISA檢測(cè)，PRRSV陰、陽(yáng)性血清每板分別做5復(fù)孔，共檢測(cè)5板。結(jié)果取平均值。在其他條件不變的情況下，根據(jù)表3中D450值，計(jì)算得到：批間的變異系數(shù)結(jié)果為小于7％。說(shuō)明不同時(shí)間制備的N蛋白在ELISA的試驗(yàn)中變異的程度相對(duì)較小，重復(fù)性相對(duì)良好（表3）。

2．2．7保質(zhì)期試驗(yàn)濕板包被比干板包被效果好，并且3周之內(nèi)可以用來(lái)檢測(cè)，3周后建議不使用，或者現(xiàn)用現(xiàn)包被也可。

2．3單克隆抗體純化和鑒定

2．3．1單克隆抗體的純化細(xì)胞融合后第8天觀察時(shí)可見(jiàn)明顯的細(xì)胞群，計(jì)算融合率＝324／384＝84．38％，陽(yáng)性率＝176／384＝44．79％。使用間接ELISA對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行必須的篩選，經(jīng)4～5次亞克隆共得到12株陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞系。以N蛋白為免疫原共獲得10株雜交瘤細(xì)胞。同時(shí)獲得2株抗組氨酸標(biāo)簽的雜交瘤細(xì)胞。利用辛酸硫酸銨沉淀獲得純化抗體，SDA－PAGE電泳結(jié)果如圖（圖3），因后續(xù)試驗(yàn)檢測(cè)出第十個(gè)抗體不與商業(yè)化試劑盒PRRSV抗原反應(yīng)，故圖中沒(méi)有第十個(gè)抗體。

2．3．2單克隆抗體特性鑒定利用sigma抗體亞型試劑盒鑒定10株抗體，抗體亞型均為IgG1型，無(wú)IgM型。

2．3．3單克隆抗體的特異性用N蛋白和其他融合蛋白進(jìn)行ELISA試驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較，最終篩選出10個(gè)針對(duì)N蛋白的抗體和兩個(gè)針對(duì)組氨酸標(biāo)簽的抗體。利用PRRSV商品化試劑盒對(duì)所得10個(gè)單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)，其中1號(hào)至9號(hào)均與試劑盒中的PRRSV病毒反應(yīng)，結(jié)果為陽(yáng)性；10號(hào)抗體結(jié)果為陰性，故10號(hào)抗體棄之不用于后續(xù)試驗(yàn)。使用間接ELISA方法測(cè)定偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2（PCV2）、豬瘟病毒（HCV）與所得單克隆抗體的反應(yīng)，并且用N蛋白做陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示這些病毒均無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)，說(shuō)明所獲得的9個(gè)單克隆抗體的特異性很好。

2．4膠體金試紙條條件優(yōu)化、組裝和特性檢測(cè)

2．4．1膠體金的質(zhì)量檢測(cè)肉眼觀測(cè)法鑒定：觀察制備好的膠體金溶液，見(jiàn)圖4A，可見(jiàn)溶液清晰通亮，顏色呈酒紅色，且色澤均勻，無(wú)分層現(xiàn)象，無(wú)固體沉淀產(chǎn)生。利用透射電鏡，對(duì)膠體金進(jìn)行掃描，圖4B可看到大小為20nm的金顆粒，形狀均勻，無(wú)三角或者多邊形產(chǎn)生。

2．4．2McAb（4G3A1）最適pH和最適標(biāo)記量最適pH值觀察結(jié)果見(jiàn)圖5，從圖中可見(jiàn)編號(hào)為8的EP管中的膠體金溶液顏色未發(fā)生明顯的變化，依然與最開(kāi)始配制時(shí)的顏色基本保持不變，而此EP管內(nèi)加入0．1mol／LK2CO3的量為10μL，故1mL配制好的膠體金溶液需加入10μL0．1mol／LK2CO3達(dá)到最適pH值，以保持溶液的穩(wěn)定。利用預(yù)試驗(yàn)中反應(yīng)良好的McAb（4G3A1）和膠體金溶液進(jìn)行結(jié)合，McAb最適標(biāo)記量如圖6所示，1、2號(hào)EP管內(nèi)的膠體金液體從紅色變?yōu)樗{(lán)色，說(shuō)明抗體量不足，不能穩(wěn)定EP管內(nèi)的膠體金溶液。從3號(hào)開(kāi)始，EP管內(nèi)的膠體金溶液顏色未發(fā)生明顯的變化，依然與最開(kāi)始配制時(shí)的顏色基本保持不變，而3號(hào)EP管內(nèi)加入抗體的量為4μg，故1mL配制好的膠體金溶液最少需加入4μg的McAb（4G3A1）達(dá)到最適標(biāo)記量，以保持膠體金溶液的穩(wěn)定。在實(shí)際大量制備金標(biāo)抗體時(shí)，在此劑量的基礎(chǔ)上再增加10％～20％即可使用。

2．4．3金標(biāo)McAb（4G3A1）最適稀釋倍數(shù)的確定將制備好的金標(biāo)McAb（4G3A1）用金標(biāo)稀釋液稀釋成不同倍數(shù)，進(jìn)行檢測(cè)，觀察試紙條的條帶顯色情況，“＋＋＋”表示條帶顏色深，背景色干凈，“＋＋”表示條帶顏色較深，或者背景有顏色，或滯留金現(xiàn)象，“＋”表示有淺色帶，或有很強(qiáng)的背景色，“－”表示無(wú)帶。通過(guò)表4比較，1∶2和1∶4稀釋的金標(biāo)抗體試驗(yàn)條帶顯色很深，但是有部分滯留金的現(xiàn)象，污染背景色；1∶8和1∶10稀釋的金標(biāo)試驗(yàn)條帶顯色很深，且無(wú)滯留金現(xiàn)象；1∶20稀釋的金標(biāo)抗體試驗(yàn)條略淺。故選擇1∶10稀釋金標(biāo)McAb（4G3A1）。

2．4．4NC膜抗體最適包被量的確定按照最適稀釋倍數(shù)稀釋金標(biāo)McAb（4G3A1），然后分別稀釋兔抗prrsvn蛋白抗體、兔抗鼠IgG，結(jié)果顯示見(jiàn)表5，當(dāng)包被量為0．2g／L時(shí)，條帶有變淺的趨勢(shì)，故選擇0．3g／L為最適NC膜的抗體包被量。

2．4．5特異性檢測(cè)用組裝好的試紙條檢測(cè)PRRSV病毒（美洲型）、胸膜肺炎菌、圓環(huán)病毒、豬瘟抗體量不足，不能穩(wěn)定EP管內(nèi)的膠體金溶液。從3號(hào)開(kāi)始，EP管內(nèi)的膠體金溶液顏色未發(fā)生明顯的變化，依然與最開(kāi)始配制時(shí)的顏色基本保持不變，而3號(hào)EP管內(nèi)加入抗體的量為4μg，故1mL配制好的膠體金溶液最少需加入4μg的McAb（4G3A1）達(dá)到最適標(biāo)記量，以保持膠體金溶液的穩(wěn)定。在實(shí)際大量制備金標(biāo)抗體時(shí)，在此劑量的基礎(chǔ)上再增加10％～20％即可使用。病毒、偽狂犬病毒和0．02mol／LPB，結(jié)果如圖4，只有PRRSV的檢測(cè)線有條帶顯示，其他的檢測(cè)線均無(wú)條帶，說(shuō)明該試紙條與其他豬類病毒無(wú)明顯交叉反應(yīng)。

2．4．6保存期試驗(yàn)將免疫膠體金診斷試紙條置于4℃條件下，放置3個(gè)月，每隔2周進(jìn)行檢測(cè)，每次3條。結(jié)果表明3個(gè)月內(nèi)試紙條的T線和C線明顯清晰，且釋放金的速度都控制在5min之內(nèi)，5min內(nèi)金全部釋放完并且可觀察到結(jié)果。

3討論

3．1關(guān)于膠體金溶液pH調(diào)節(jié)的方法的改進(jìn)利用檸檬酸三鈉法制備20nm金顆粒的研究有很多［12－14］，在后續(xù)試驗(yàn)中為了穩(wěn)定膠體金液體，通常涉及到pH調(diào)節(jié)問(wèn)題，本試驗(yàn)不再拘泥于pH的具體數(shù)值，而是通過(guò)給出K2CO3的所需量來(lái)對(duì)pH進(jìn)行調(diào)節(jié)。因?yàn)楸旧砟z體金溶液pH的調(diào)節(jié)就是1個(gè)相對(duì)麻煩的過(guò)程，溶液會(huì)對(duì)pH儀器的探頭產(chǎn)生損害，而且每個(gè)儀器還都會(huì)有相對(duì)的差別，因此選用這種方法，即避免了儀器損傷，又忽略了儀器質(zhì)檢的偏差，而且更加適用于大范圍溶液的制備過(guò)程。

3．2本試紙條與國(guó)內(nèi)外相關(guān)方法的比較免疫膠體金研究與ELISA試驗(yàn)相似，也有經(jīng)常利用的蛋白，N蛋白和M蛋白的單克隆抗體就是膠體金研究常用的蛋白：方瑩等［15］第一次應(yīng)用了免疫膠體金試紙技術(shù)對(duì)PRRSV病毒進(jìn)行快速檢測(cè)方法：分別把膠體金PRRSV、兔抗PRRSV抗體和PRRSV噴在玻璃纖維和硝酸纖維素膜的對(duì)照線和檢測(cè)線上，這些構(gòu)成免疫金標(biāo)試紙的主要部分，隨后再與美國(guó)IDEXXPRRSVKit相比較，結(jié)果相差不大。崔尚金等［16］用重組N蛋白研發(fā)了PRRSV免疫膠體金抗體的檢測(cè)技術(shù)；周勝華等［17］利用抗M蛋白和抗N蛋白的單克隆抗體，檢測(cè)病料中的PRRS病毒。該方法只能用于檢測(cè)中國(guó)已經(jīng)存在的PRRSV毒株而不能用于檢測(cè)歐洲型毒株［18］。本試驗(yàn)參照上述方法利用重組蛋白制備膠體金試紙，用于檢測(cè)相關(guān)的國(guó)內(nèi)病毒，并進(jìn)行了較為詳細(xì)的步驟敘述，使得結(jié)果更為信服。在后續(xù)的試驗(yàn)中，希望檢測(cè)范圍得以擴(kuò)大。

作者：姚瑤趙宇亮王勇鑫 趙寶華單位：河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院