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《中華中醫(yī)藥雜志》2014年第七期

一、中醫(yī)證候動物模型的一般評價方法

1.宏觀辨癥表征動物的一般狀態(tài)較易觀察。根據(jù)中醫(yī)理論，觀察動物的宏觀表征。如觀察腎陽虛模型多有畏寒喜暖、大便稀溏、小便清長、卷縮拱背、精神萎頓、倦怠嗜睡、自主活動次數(shù)明顯減少等表現(xiàn)[11]。李志強等[12]制造的脾虛模型組動物在4d后開始出現(xiàn)攝食明顯減少、倦怠、懶動、畏寒、毛發(fā)疏散不潔或豎毛等現(xiàn)象，與臨床上脾虛證的癥狀較相似。2.微觀測定指標學術界對評價證候模型的微觀指標進行不懈研究并取得一定收獲。王喜軍等[13]在研究六味地黃丸血中移形成分對氫化可的松致大鼠腎虛動物模型的保護作用時，采用皮下注射氫化可的松注射液制造大鼠腎陰虛模型，測定其微觀指標如下：體質(zhì)量、胸腺和脾臟重量、心率、血清超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathioneperoxidase，GSH-PX）活力，血漿黏度、血清一氧化氮（nitricoxide，NO）值、血清內(nèi)皮素（endothelin，ET）值、血清睪酮（testosterone，T）值、雌二醇/睪酮（E2/T）值、血清游離甲狀腺素（freethyroxine，F(xiàn)T4）、堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）值。任建勛等[14]采用半高脂高糖飼料復合睡眠剝奪建立大鼠氣虛血瘀證動物模型，測定凝血功能測定凝血酶原時間、活化部分凝血激酶時間、纖維蛋白原；血管活性分子測定血管緊張素Ⅱ、ET、血栓素B2（thromboxaneB2，TXB2）等微觀指標。3.以方（藥）測證確認模型動物證候?qū)傩浴耙苑綔y證”作為一種方法，最初主要應用于《傷寒論》和《金匱要略》方證條文的研究，主要根據(jù)方劑藥味組成及其效用來推測其所主治對象的病機或癥狀[15]。冉秋等[16]將已經(jīng)采用6-羥基多巴胺損毀注射法成功制作帕金森模型的SD大鼠分別灌飼桃紅四物湯、滌痰湯和天麻鉤藤飲，45d后發(fā)現(xiàn)天麻鉤藤飲對帕金森病模型相關性和中醫(yī)證候相關性的幾個指標改善程度上遠強于桃紅四物湯和滌痰湯，據(jù)此認為其中醫(yī)證候?qū)傩詫儆陉幪搫语L證。王文萍等[17]首先建立慢性間歇性缺氧小鼠模型，每天同時灌服生脈散水提液，發(fā)現(xiàn)生脈散對模擬氣陰兩虛證的慢性缺氧小鼠自發(fā)活動、心電圖等指標的異常改變改善作用顯著，據(jù)此初步認定其中醫(yī)證候?qū)傩詫儆跉怅巸商撟C。

二、代謝組學

目前，缺乏客觀量化指標是中醫(yī)證候動物模型評價的最大挑戰(zhàn)。將抽象的中醫(yī)證候診斷與客觀的量化指標相聯(lián)系，是實現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的必要途徑。代謝組學作為系統(tǒng)生物學的重要組成部分，在方法學上具有無創(chuàng)、在體、動態(tài)等特點，與中醫(yī)學診治中整體動態(tài)性原則具有相似性[18]。其研究過程包括樣品制備，代謝產(chǎn)物分離、檢測與鑒定，數(shù)據(jù)分析與模型建立3個部分，通過核磁共振（nuclearmagneticresonance，NMR）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquidchromatography-massspectromery，LC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gaschromatography-massspectrometry，GC-MS）技術分析尿液、血漿或血清、唾液及細胞和組織的提取液等生物樣品[19]，結合模式識別、專家系統(tǒng)等分析方法，尋找生物標志物，研究相關代謝物變化涉及的代謝途徑和變化規(guī)律，以闡述生物體對外界刺激的反應機制[20]。代謝組學是生物體整體功能狀態(tài)的“生化表現(xiàn)”，可以用來表征中醫(yī)思想中的“諸內(nèi)”，中醫(yī)思想與代謝組學思想是“外與內(nèi)”的結合[21]。代謝組學應用于中醫(yī)證候動物模型研究現(xiàn)狀近年來，國內(nèi)已經(jīng)有許多學者將代謝組學技術應用于中醫(yī)證候動物模型研究中，通過分析生物樣品，尋找中醫(yī)證候的生物標記物。WangX等[22]利用UPLC/HDMS對左冠狀動脈結扎法制作的心氣虛證大鼠尿液進行了代謝組學研究，檢測尿液代謝輪廓，經(jīng)主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）得心氣虛組與空白組有顯著差異，結合正交偏最小二乘判別分析方法（O-PLS-DA）找到17種潛在生物標志物，根據(jù)MS/MS碎片離子圖及HDMB、MetPA等數(shù)據(jù)庫對其進行結構鑒定和代謝通路分析。這些生物標志物與糖酵解或糖異生途徑，不飽和脂肪酸、脂肪酸的生物合成，嘌呤代謝途徑有關。給予溫心方后，其中12種標志物回調(diào)至正常水平，證明了溫心方治療心氣虛作用。PingWang等[23]利用UPLC/HDMS對甲狀腺素和利血平誘導的腎陰虛證大鼠尿液進行了代謝組學研究，找到20個潛在生物標志物，根據(jù)MS/MS碎片離子圖鑒定其為尿酸、氨基脂肪、氨基葡萄糖等。給予六味地黃丸后，發(fā)現(xiàn)低劑量組與空白組代謝水平最為接近，為評價中藥方劑提供新方法。XijunWang等[24]利用UPLC/MS結合多變量分析方法對臨床中黃疸病人的尿液進行代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)并鑒定44個黃疸證生物標志物，包括β-Citryl-L-谷氨酸、二甲基鳥苷、吲哚谷氨酰胺等，同時鑒定40個陽黃亞型生物標志物及49個陰黃亞型生物標志物，該研究依據(jù)臨床實驗為動物模型的復制與評價提供方法。BoYang等[25]運用UPLC/HDMS結合模式識別方法對果蠅進行代謝組學研究，分析鑒定20個失眠癥潛在生物標志物，主要與氨基酸代謝和脂肪酸代謝相關聯(lián)，并根據(jù)其改變揭示酸棗仁湯的作用機制。嚴蓓等[26]運用GCTOF/MS法對心血瘀阻證與氣陰兩虛證心肌缺血大鼠模型進行代謝組學的表征與識別。血瘀組皮下注射鹽酸腎上腺素，冰水冷刺激致血瘀模型；氣陰兩虛組剝奪睡眠致氣血兩虛模型。對各組血漿數(shù)據(jù)用PCA和最小二乘判別式分析進行降維，發(fā)現(xiàn)纈氨酸、2-氨基丁酸、甘氨酸等是區(qū)分兩種病證的潛在生物標志物。為探索中醫(yī)肝郁脾虛證的物質(zhì)基礎和分子生物學診斷指標，ZhangA等[27]利用UPLC/HDMS結合多變量分析與通路分析篩選與肝郁脾虛證相關的4個生物標志物，即脯氨酰基羥脯氨酸，L-高半胱氨酸，2-辛醇肉堿和α-N-苯乙?；?谷氨酰胺，此研究同時為動物模型復制提供依據(jù)。潘秋等[28]運用GC-MS法對糖尿病大鼠脾氣虧虛、痰瘀互阻證的尿液進行代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)第6周模型組較空白組L-抗壞血酸、D-葡萄糖酸、丙氨酸、十八烷酸和戊二酸含量增加；與第3周相比，第6周模型組尿液中以上物質(zhì)增加。根據(jù)以上幾種代謝物的組合規(guī)律及含量變化，初步闡釋糖尿病大鼠中醫(yī)證候的相關代謝物特征。羅和古等[29]運用1H-NMR法對肝郁脾虛大鼠模型的血漿進行代謝組學分析，尋找肝郁脾虛證候的潛在生物標記物。以慢性束縛方法制作肝郁脾虛模型，對正常組、模型組7d及21d大鼠的血漿1H-NMR譜進行PCA，發(fā)現(xiàn)醋酸、乳酸、酪氨酸等5種代謝物可作為肝郁脾虛證的生物標志物。劉志剛等[30]運用HPLC-MS/MS法對肺氣虛型大鼠模型的血漿進行代謝組學分析。以“COPD肺氣虛證動物模型”復制法復合木瓜蛋白酶霧化吸入法復制COPD肺氣虛證模型大鼠。通過對照組與模型組血漿代謝物的檢測，發(fā)現(xiàn)代謝特征有明顯區(qū)別，經(jīng)鑒定精胺、雙氫神經(jīng)酰胺、十二烷二酰肉堿等10種變化顯著的代謝物質(zhì)，作為COPD肺氣虛證潛在的疾病標志物。

三、展望與思考

中醫(yī)證候動物模型的建立與評價經(jīng)歷了長時間的發(fā)展，但現(xiàn)在仍處于探索階段，并存在著許多問題和爭議。主要源于證本質(zhì)研究尚未完善，臨床診斷信息無法應用于動物模型評價中。由于個體差異，相同的因素不一定會導致相同的證候；宏觀表征主觀性強，不能作為評價的唯一指標；學術界公認的證候客觀指標并不多，缺乏特異性等，這些都成為阻礙中醫(yī)證候動物模型發(fā)展的因素。代謝組學是一種采用系統(tǒng)生物學思路研究代謝小分子組的高通量分析方法，通過比較不同條件下的小分子代謝譜，找到具有意義的生物標志物[31-32]，為客觀評價中醫(yī)證候模型提供了新的思路與依據(jù)，為實現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化起到推動作用。證本質(zhì)研究又是證型規(guī)范化的前提與基礎，是中西醫(yī)兩種醫(yī)學體系深層次溝通的必由途徑。所以深入地探索中醫(yī)“證”的診斷或評價指標，嘗試對其進行定性定量的表達研究，是中醫(yī)證型規(guī)范化及建立中醫(yī)療效評價指標體系的關鍵途徑，具有實際的臨床應用價值。筆者認為利用代謝組學技術充分認識中醫(yī)證候/病的生物學本質(zhì)，確定證/病的生物標記物，以證/病的生物標記物為橋接復制與證/病關聯(lián)的動物模型。建立中醫(yī)方證代謝組學研究的關鍵技術[33]，充分發(fā)揮代謝組學以體液中全部小分子代謝產(chǎn)物組為對象探討外源性物質(zhì)對機體效應的研究優(yōu)勢，進行效應生物標記物確定；從整體上來探討生命活動在代謝層面的特征和規(guī)律，使代謝物含量變化與生物表型的改變建立直接關聯(lián)，能夠更準確地反映生物體系的狀態(tài)，揭示疾病發(fā)生發(fā)展的代謝機制，發(fā)現(xiàn)和篩選生物標志物，并能為進一步探索治療靶點提供重要信息。

作者：于靜波孫暉韓越張愛華閆廣利韓瑩王喜軍單位：黑龍江中醫(yī)藥大學中藥血清藥物化學國家中醫(yī)藥管理局重點實驗室