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【摘要】目的地西他濱具有較好的抗腫瘤活性，其分子機(jī)制與DNA去甲基化有關(guān)，本研究通過DAC對腺瘤性結(jié)腸息肉病基因的表達(dá)水平和去甲基化的影響，探討DAC誘導(dǎo)宮頸腺癌Hela細(xì)胞凋亡分子機(jī)制。方法不同濃度的DAC作用于宮頸腺癌Hela細(xì)胞24、36和48h，MTT法檢測對宮頸癌細(xì)胞的增殖抑制作用，觀察DAC對Hela細(xì)胞增殖的濃度依賴效應(yīng)和時(shí)間依賴效應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測DAC對宮頸腺癌Hela細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。在DAC作用于宮頸腺癌Hela細(xì)胞前后，通過甲基化特異性PCR檢測APC基因的甲基化狀態(tài)；RT－PCR法檢測APC基因mRNA表達(dá)水平；蛋白質(zhì)印跡法檢測APC蛋白、β－catenin蛋白在胞內(nèi)及核內(nèi)表達(dá)的變化。結(jié)果DAC對宮頸腺癌Hela細(xì)胞增殖抑制具有濃度依賴效應(yīng)和時(shí)間依賴效應(yīng)，Hela細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（IC50）24、36、48h分別為28．23、7．65和5．64μmol／L。DAC處理后的宮頸腺癌Hela細(xì)胞的凋亡率為（73．82±0．11）％，明顯高于對照組的（12．41±0．24）％，P＜0．001。DAC處理Hela細(xì)胞后，S期細(xì)胞比例（47．82±2．57）％和G2期細(xì)胞比例（30．87±2．28）％顯著高于空白對照組的S期細(xì)胞比例（24．08±0．71）％和G2期細(xì)胞比例（2．52±0．84）％，P＜0．001。DAC處理后，APC基因啟動子區(qū)域去甲基化狀態(tài)明顯增高，APCmRNA表達(dá)量上升，處理前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0．05。DAC處理后，胞內(nèi)APC蛋白表達(dá)上調(diào)，而胞內(nèi)和核內(nèi)的β－catenin蛋白表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0．05。結(jié)論DAC可通過對APC基因的去甲基化作用，上調(diào)胞內(nèi)APC蛋白表達(dá)，下調(diào)胞內(nèi)和核內(nèi)β－catenin表達(dá)，誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】地西他濱；Hela細(xì)胞；甲基化；凋亡；宮頸癌

宮頸癌是我國最常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均較高。我國宮頸癌的發(fā)病率近年來呈年輕化的趨勢，嚴(yán)重威脅著女性健康［1］。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)改變的主要分子機(jī)制之一，目前正受到科學(xué)家們的高度重視和關(guān)注［2－3］。腺瘤性結(jié)腸息肉病基因甲基化水平上調(diào)導(dǎo)致的基因功能下調(diào)是宮頸腺癌發(fā)生的早期事件，具有早期診斷的敏感性和特異性，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的全過程中穩(wěn)定存在［4］，通過抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性，能夠阻斷異常APC基因的異常甲基化，導(dǎo)致APC蛋白活性恢復(fù)。地西他濱（decitabine，DAC）是目前臨床上常用抗癌藥物，也是常見的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑之一［5］。臨床上，DAC對急性髓性白血病和慢性髓性白血病等均有明顯療效。DAC用于宮頸癌的治療目前鮮見報(bào)道，本研究從分子水平探討DAC對宮頸癌的作用機(jī)制，為今后臨床應(yīng)用治療宮頸腺癌提供新的思路和實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，也可為宮頸腺癌的分子靶向治療提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1．1主要試劑

DAC購自美國Sigma公司，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自北京四正柏生物公司，鼠抗人APC單克隆抗體購自美國RD公司，PCR試劑盒購自上海生工公司。

1．2細(xì)胞培養(yǎng)宮頸腺癌

Hela細(xì)胞，用含10％FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于溫度37℃、5％CO2、相對濕度為90％的恒溫培養(yǎng)箱中，進(jìn)行培養(yǎng)。

1．3MTT檢測

用0．25％的胰酶消化并收集生長狀態(tài)良好的宮頸腺癌Hela細(xì)胞（保證細(xì)胞處于單細(xì)胞懸浮狀態(tài)），將細(xì)胞調(diào)整到約104個(gè)／孔的密度鋪種于96孔板，每孔體積約200μL，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜；待細(xì)胞密度生長至80％以上時(shí)（一般培養(yǎng)過夜后），加處理因素。設(shè)空白對照組和DAC處理組，處理組藥物濃度設(shè)為0．1、1、10和20μmol／L4個(gè)濃度，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。在培養(yǎng)24、36、48h時(shí)加入MTT液20μL／孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，將上清液輕輕吸凈，再加入DMSO200μL／孔，予振蕩搖勻10min，待結(jié)晶溶解后。酶標(biāo)儀設(shè)定檢測A為570nm，測出各孔的吸光度，計(jì)算抑制率，并繪制出不同細(xì)胞系的生長曲線。

1．4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及凋亡

將人宮頸腺癌Hela細(xì)胞調(diào)整為2×105mL－1，接種在6孔無菌培養(yǎng)板中，每個(gè)孔共4mL，Hela細(xì)胞DAC的最終濃度為10μmol／L，每組均設(shè)復(fù)孔3個(gè)，設(shè)不加藥對照孔。置于37℃、5％CO2飽和濕度條件的培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)36h后，收集細(xì)胞以進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀測定。

1．5MSP檢測APC基因甲基化狀況

首先按試劑說明書提取DNA，置于－20℃保存。紫外分光光度計(jì)檢測DNA濃度。DNA濃度計(jì)算為A260×200×50μg／mL。鑒定DNA純度可通過計(jì)算A260／A280比值。MSP檢測主要步驟如下：（1）DNA亞硫酸鹽修飾：充分振蕩進(jìn)行混勻后，室溫下孵育約5～10min。

（2）重懸DNA：4℃，1000r／min，離心1min（r＝15cm），棄上清，離心管底部可見一小塊白色沉淀物即為DNA，加1mL的70％乙醇之后振蕩，4℃，500r／min，離心1min（r＝15cm），棄上清。每個(gè)樣本中均加入30μL的TE緩沖液溶解，快速強(qiáng)力振蕩，直到沉淀完全重懸，置于50～60℃水浴15min，以使DNA完全溶解，高速離心2～3min后，用吸管吸取上清液到一個(gè)新的微量離心管中，繼續(xù)進(jìn)行MSP檢測或儲存于－20℃（可保存≥2個(gè)月）或－80℃（可保存6個(gè)月以上）備用。

（3）設(shè)計(jì)APC甲基化和非甲基化引物，一組是甲基化引物（M），一組是非甲基化引物（U），引物序列APC－M上游引物為5′－GGTATATT－TTCGAGGGGTACG－3′，下游引物為5′－TTCCCGA－CCCGCACTCCGC－3′，退火溫度56℃，擴(kuò)增片段為90bp；APC－U上游引物為5′－TGTGAGGGTATAT－TTTTGAGGGGTAT－3′，下游引物為5′－CTTCTCT－CTCCACTTCCCAACCCA－3′，退火溫度56℃，擴(kuò)增片段為109bp。

（4）MSP反應(yīng)：PCR反應(yīng)液：在冰浴條件下配制反應(yīng)體系25μL，將下列各成分加入到0．2mL的無菌EP管中：10×TaqBuffer2．5μL，TaqHotstart0．15μL，dNTP2．0μL，上引物1μL，下引物1μL，DNA3μL，TaqDNA聚合酶（1U／μL）1μL，H2O補(bǔ)足25μL。PCR反應(yīng)條件：95℃5min，95℃45s，56℃45s，72℃45s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min，10℃結(jié)束反應(yīng)，各PCR產(chǎn)物－20℃冰箱保存。

（5）電泳及結(jié)果判斷：8μL的PCR產(chǎn)物中，加入1．5μL的電泳上樣緩沖液，進(jìn)行充分地混勻，加樣于2．5％的瓊脂糖凝膠上，進(jìn)行電泳，設(shè)定電壓為88V，電泳40min后，通過凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行觀察并保存結(jié)果。

（6）陽性的結(jié)果判斷：擴(kuò)增后，如果甲基化產(chǎn)物中有目的條帶，而非甲基化產(chǎn)物中沒有目的條帶，則說明APC發(fā)生了甲基化，如果在非甲基化產(chǎn)物中出現(xiàn)目的條帶，而在甲基化產(chǎn)物中不出現(xiàn)目的條帶；則說明基因未發(fā)生甲基化，如果APC－甲基化引物和APC－非甲基化引物擴(kuò)增時(shí)，同時(shí)出現(xiàn)了擴(kuò)增條帶，則說明APC發(fā)生了不完全甲基化。

1．6RT－PCR檢測

APC上游引物為5′－GTCCCTCCGTTCTTATG－GAA－3′，下游引物為5′－GGCTATTCTTCGCTGTG－CTC－3′，擴(kuò)增片段385bp。β－actin上游引物為5′－G－GACCTGACTGACTACCTC－3′，下游引物為5′－CA－TACTCCTGCTTGCTGAT－3′，擴(kuò)增片段553bp。cDNA逆轉(zhuǎn)錄按說明書上步驟進(jìn)行操作：按20μL體積進(jìn)行配制，在冰上操作，反應(yīng)體系如下：5×ReveresBuffer4μL，10mmoldNTP2μL，RNA酶抑制劑0．5μL，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶0．5μL，Oligo（dT）18引物1μL，TotalRNA2μg，加入無RNA酶水，定容至20μL，55℃30min，85℃5min，冰上終止反應(yīng)。PCR擴(kuò)增，體系如下：2×TaqMasterMix10μL，上游引物10μmol／L1μL，下游引物10μmol／L1μL，cD－NA2μL，Rnase－FreeWater定容至25μL。PCR儀上65℃孵育5min，然后置冰上冷卻。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃5min，變性94℃30s，53℃30s，55℃40s，72℃30s，72℃7min，4℃冷卻，35個(gè)循環(huán)。取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，以DL－Mark2000作為指示，恒壓100V電泳30min左右。凝膠成像后分析灰度值，計(jì)算目的基因的表達(dá)量。

1．7蛋白質(zhì)印跡法檢測

（1）分別收集DAC處理36h的Hela細(xì)胞5×106個(gè)細(xì)胞，按提取試劑盒步驟分別提取總蛋白與核蛋白。立即使用，或－70℃凍存。BCA蛋白濃度測定法分別取總蛋白和核蛋白測定濃度。

（2）蛋白質(zhì)變性：加SDS上樣并緩沖液混勻，沸水煮5min后，冰上放置2min，－80°C保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）SDS－PAGE電泳：80V電泳約30min，再100V電泳溴酚藍(lán)跑到底時(shí)終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

（4）轉(zhuǎn)膜：濕轉(zhuǎn)法，100V恒壓90min。

（5）封閉、孵育抗體：5％脫脂奶粉封閉之后，予5％BSA稀釋一抗，4℃，搖床過夜。用5％脫脂奶粉稀釋二抗，室溫脫色搖床上搖動1．5h。

（5）化學(xué)發(fā)光、顯影、定影及分析，灰度掃描。

1．8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS18．0分析，以x－±s表示，兩兩比較采用χ2檢驗(yàn)，多組之間采用非參數(shù)K檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0．05。

2結(jié)果

2．1對宮頸腺癌Hela細(xì)胞生長抑制作用

MTT法檢測結(jié)果顯示，當(dāng)DAC處理后，不同時(shí)間點(diǎn)上，細(xì)胞的抑制率隨著DAC濃度的增加（0．1、1、10和20μmol／L）呈上升趨勢，高濃度（20μmol／L）對細(xì)胞的增殖抑制最明顯。說明DAC對宮頸腺癌Hela細(xì)胞的生長抑制有濃度依賴效應(yīng)。不同時(shí)間點(diǎn)DAC處理后各組之間的Hela細(xì)胞抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意，P＜0．001。DAC對宮頸腺癌Hela細(xì)胞的生長抑制有時(shí)間依賴效應(yīng)。細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（IC50）24、36、48h分別為28．23、7．65和5．64μmol／L。根據(jù)不同濃度不同時(shí)間所得的IC50值，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇最佳濃度為10μmol／L，最佳處理時(shí)間36h。

2．2對宮頸腺癌Hela細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果如圖2顯示，DAC處理后宮頸腺癌Hela細(xì)胞的凋亡率為（73．82±0．11）％，明顯高于對照組的（12．41±0．24）％，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意，P＜0．001。

2．3對宮頸腺癌Hela細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

DAC處理Hela細(xì)胞后，S期細(xì)胞比例（47．82±2．57）％和G2期細(xì)胞比例（30．87±2．28）％明顯高于空白對照組的S期細(xì)胞比例（24．08±0．71）％和G2期細(xì)胞比例（2．52±0．84）％，處理前后比較，S期和G2期細(xì)胞比例差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0．001；表明DAC主要阻滯宮頸腺癌Hela細(xì)胞于S期和G2期。

2．4對APC基因甲基化的影響

MSP法檢測DAC處理前后Hela細(xì)胞的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)Hela細(xì)胞株中存在APC基因啟動子區(qū)的高甲基化，經(jīng)過DAC處理之后出現(xiàn)較明顯非甲基化條帶，表現(xiàn)部分甲基化狀態(tài)，甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)減少，非甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物增多（圖3）。表明DAC可以明顯逆轉(zhuǎn)Hela細(xì)胞株APC基因甲基化狀態(tài)。

2．5對APCmRNA表達(dá)影響

無DAC干預(yù)的情況下，APC基因的表達(dá)量低；DAC處理后APC基因mRNA的表達(dá)水平明顯升高，處理前APCmRNA的相對表達(dá)量為0．823±0．21，處理后相對表達(dá)量為0．279±0．17，兩樣本比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0．001（圖4）。表明DAC可促進(jìn)APCmRNA的表達(dá)。注：Marker．DNA標(biāo)記；U．非甲基化引物擴(kuò)增后DNA條帶；M．甲基化引物擴(kuò)增后DNA條帶圖3地西他濱處理前后Hela細(xì)胞中APC基因的甲基化狀態(tài)圖4RT－PCR檢測地西他濱對宮頸癌Hela細(xì)胞APCmRNA表達(dá)的影響

2．6APC蛋白和β－catenin蛋白的表達(dá)

DAC處理組APC蛋白相對表達(dá)量為1．542±0．053，未處理組胞內(nèi)相對表達(dá)量為0．780±0．021；未處理組胞內(nèi)β－catenin蛋白相對表達(dá)量為0．890±0．032，DAC處理組相對表達(dá)量為0．354±0．015；DAC處理組中APC蛋白表達(dá)水平增加，β－catenin蛋白表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0．001（圖5）。說明DAC促進(jìn)胞內(nèi)APC蛋白表達(dá)，抑制β－catenin蛋白表達(dá)。由于APC蛋白在核內(nèi)不表達(dá)，所以僅檢測核蛋白中β－catenin蛋白在DAC干預(yù)前后的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，空白對照組核內(nèi)β－catenin蛋白相對表達(dá)量為0．632±0．036，高于實(shí)驗(yàn)組相對表達(dá)量的0．336±0．013，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0．001。說明DAC抑制核內(nèi)β－catenin蛋白表達(dá)。

3討論

宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與表觀遺傳學(xué)異常有很大的聯(lián)系，人們普遍認(rèn)為引起宮頸癌的一個(gè)重要原因是腫瘤相關(guān)基因啟動子區(qū)域CpG島的高甲基化［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，DNA啟動子發(fā)生甲基化后，可影響基因轉(zhuǎn)錄過程中的模板DNA鏈與RNA聚合酶的結(jié)合，降低基因的轉(zhuǎn)錄活性，抑制抑癌基因的表達(dá)，引起腫瘤細(xì)胞的異常增殖，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［6］。DNA甲基化是許多抑癌基因功能失活的機(jī)制之一，且在某些情況下，甚至是許多抑癌基因功能失活的唯一方式，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化參與了癌癥啟動過程和進(jìn)展［2－3］。由于DNA甲基化具有可逆性的特點(diǎn)，表達(dá)沉默的抑癌基因、DNA損傷修復(fù)基因、細(xì)胞周期調(diào)控基因以及信號通路中的某些關(guān)鍵調(diào)控因子等出現(xiàn)異常甲基化后，可以在DNA甲基化抑制劑的作用下逆轉(zhuǎn)而發(fā)生去甲基化，可恢復(fù)抑癌基因的活性從而抑制腫瘤的生長，這對于抗腫瘤治療來說是十分有意義的。

APC基因是在Wnt／β－catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要抑癌基因，研究發(fā)現(xiàn)，APC基因啟動子的高甲基化及基因轉(zhuǎn)錄缺失見于多種腫瘤，也是與宮頸腺癌發(fā)生密切相關(guān)的抑癌基因［7－9］。APC基因甲基化水平的上調(diào)導(dǎo)致的基因功能下調(diào)是宮頸腺癌發(fā)生的早期事件，具有早期診斷的敏感性和特異性，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的全過程中穩(wěn)定存在［10］，APC蛋白與β－catenin結(jié)合時(shí)，能夠促進(jìn)β－catenin的絲氨酸和蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化，繼而β－catenin在蛋白酶體中發(fā)生降解。若APC蛋白出現(xiàn)缺失，則無法與β－catenin蛋白結(jié)合，胞質(zhì)中積累的β－catenin通過轉(zhuǎn)位進(jìn)入到細(xì)胞核中，與Tcf－4結(jié)合形成復(fù)合體，啟動增殖相關(guān)基因（如c－myc，CyclinD1）的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的生長失控［11］。有研究發(fā)現(xiàn)，APC甲基化水平與宮頸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)，宮頸癌組APC基因甲基化率56．8％明顯高于正常對照組的10％；APC甲基化陽性率隨腫塊增大及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而增高；且與不同宮頸癌病理類型相關(guān)［12］。DAC是目前臨床上常用抗癌藥物，也是常見的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑之一，屬于脫氧胞苷酸的腺苷類似物。DAC使已經(jīng)發(fā)生高度甲基化的基因發(fā)生去甲基化改變，并激活沉默失活的基因，使得抑癌基因功能活化，促凋亡分子表達(dá)水平的增高，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長［13］。

DAC能夠逆轉(zhuǎn)多種實(shí)體瘤的惡性生物學(xué)行為，但目前并不清楚它對宮頸腺癌細(xì)胞是否也有類似的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，DAC對宮頸腺癌Hela細(xì)胞的生長抑制有時(shí)間依賴和濃度依賴效應(yīng)；DAC能顯著誘導(dǎo)宮頸腺癌Hela細(xì)胞凋亡，且主要阻滯在細(xì)胞周期的S期和G2期，表明DAC促進(jìn)宮頸腺癌Hela細(xì)胞凋亡是由于能影響細(xì)胞的分裂和DNA后期的合成。DAC誘導(dǎo)APC去甲基化主要是通過該基因5’端啟動子區(qū)CpG島去甲基化而實(shí)現(xiàn)，在本研究中，未經(jīng)DAC處理的宮頸腺癌Hela細(xì)胞，其APC基因出現(xiàn)高甲基化。而使用去甲基化藥物DAC處理后，Hela細(xì)胞的APC基因出現(xiàn)了較明顯的去甲基化，這表明DAC對Hela細(xì)胞中的APC基因有去甲基化作用。進(jìn)一步采用RT－PCR方法檢測APCmRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，DAC處理后甲基化水平下調(diào)，而APCmRNA的表達(dá)量明顯增加，說明了在DAC能夠使APC基因5’端啟動子區(qū)CpG島發(fā)生去甲基化，恢復(fù)APC基因的活性，導(dǎo)致APC基因的mRNA和蛋白表達(dá)均上調(diào)。DAC可通過對APC基因的去甲基化作用，誘導(dǎo)宮頸腺癌Hela細(xì)胞凋亡。DAC處理后APC蛋白明顯增加，β－catenin蛋白明顯減少，有助于抑制腫瘤生長。APC蛋白與β－catenin蛋白均為Wnt／β－catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的物質(zhì)，此結(jié)果說明DAC作用于宮頸腺癌Hela細(xì)胞后，Wnt／β－catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)物量減少，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長。說明DAC可通過下調(diào)胞內(nèi)和核內(nèi)β－catenin表達(dá)抑制Wnt／β－catenin信號通路，誘導(dǎo)宮頸腺癌Hela細(xì)胞凋亡。總之，DAC誘導(dǎo)APC基因去甲基化可能是通過抑制WNT信號通路并促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療腫瘤的目的，為特異性甲基化酶抑制劑應(yīng)用于臨床治療提供了有用理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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作者：宋汶珂；唐彩霞；黃彤輝；孫曉紅 單位：南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院婦產(chǎn)科