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《農(nóng)藥學(xué)學(xué)報》2016年第二期

摘要：

建立了環(huán)氧蟲啶在柑橘和土壤中殘留量測定的高效液相色譜(HPLC-UVD)分析方法。柑橘樣品采用V(蒸餾水)∶V(二氯甲烷)=1∶2提取后經(jīng)弗羅里硅土柱凈化(土壤樣品提取后直接測定)，HPLC-UVD測定，外標法定量，并運用此方法對田間樣品進行了環(huán)氧蟲啶殘留量檢測驗證。結(jié)果表明：在0.05~5mg/L范圍內(nèi)，環(huán)氧蟲啶質(zhì)量濃度與對應(yīng)的峰面積間呈良好線性關(guān)系，線性方程為y=10243x+233.0(R2=0.9990)；土壤和柑橘中環(huán)氧蟲啶的最低檢測濃度均為0.1mg/kg；在0.1~1mg/kg3個添加水平下，環(huán)氧蟲啶在土壤和柑橘中的平均回收率在76%~93%之間，相對標準偏差(RSD,n=5)在1.6%~5.8%之間。該方法快速、靈敏、穩(wěn)定，可用于柑橘和土壤中環(huán)氧蟲啶殘留量的檢測。

關(guān)鍵詞:

高效液相色譜；環(huán)氧蟲啶；柑橘；土壤；殘留

環(huán)氧蟲啶(cycloxaprid)，化學(xué)名稱為9-[(6-氯吡啶-3-基)甲基]-4-硝基-8-氧雜-10,11-二氫咪唑并[2,3-a]雙環(huán)[3,2,1]辛-3-烯)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖式1，是中國華東理工大學(xué)和上海生農(nóng)生化制品有限公司聯(lián)合開發(fā)的一類順硝烯氧橋雜環(huán)新煙堿類殺蟲劑，主要用于半翅目害蟲如稻飛虱、蚜蟲、煙粉虱等的防治[1]，其作用機理與之前的新煙堿類殺蟲劑有著本質(zhì)的區(qū)別，是國際上首個nAChR抗結(jié)劑[2-3]。Shao等[4]的研究表明，環(huán)氧蟲啶和蚍蟲啉對蚜蟲的LC50值分別為0.00471和0.3502mmol/L，對粘蟲的LC50值分別為0.03873和0.12549mmol/L，環(huán)氧蟲啶活性顯著優(yōu)于吡蟲啉。環(huán)氧蟲啶對哺乳動物的急性毒性屬低毒，低于傳統(tǒng)的新煙堿類殺蟲劑，對非靶標生物如水蚤類、魚類、土壤微生物和其他植物的影響甚微，對蜜蜂的毒性與吡蟲啉相比也顯著降低[5-6]，極有可能成為國際上具有重要影響力的新一類殺蟲劑。目前，對環(huán)氧蟲啶的研究主要集中在生物活性[7-10]、作用方式[11-12]和環(huán)境行為[13-18]等方面。根據(jù)國際上農(nóng)藥殘留物定義，環(huán)氧蟲啶在柑橘中的殘留是必檢項目[19]，而有關(guān)環(huán)氧蟲啶在環(huán)境基質(zhì)中殘留量的分析方法研究甚少[20-21]。目前未見文獻報道環(huán)氧蟲啶在柑橘土壤、橘皮、橘肉、全果中殘留的檢測方法，國際上也未制定食品中環(huán)氧蟲啶的MRL值[22-23]。故筆者以水-二氯甲烷為提取劑，柑橘樣品超聲提取后經(jīng)弗羅里硅土柱凈化(土壤樣品提取液直接測定)，建立了環(huán)氧蟲啶殘留的HPLC-UVD檢測方法，并應(yīng)用該方法對25%環(huán)氧蟲啶可濕性粉劑在田間柑橘和土壤樣品中的殘留量進行了檢測，以期為環(huán)氧蟲啶在環(huán)境中的殘留監(jiān)測提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器與藥劑LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司，帶紫外檢測器和LCsolution化學(xué)工作站)；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；DLSB-5L/25低溫冷卻液循環(huán)泵、玻璃儀器氣流烘干器及SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵(河南省鞏義市英峪予華儀器廠)；JYL-B062九陽料理機(九陽股份有限公司)；TD5A臺式高速離心機(長沙英泰離心機儀器有限公司)；BOMEX層析柱(1.5cm×20cm，天津市天波玻璃儀器有限公司)。99.5%環(huán)氧蟲啶(cycloxaprid)標準品(農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所)；25%環(huán)氧蟲啶可濕性粉劑(上海生農(nóng)生化制品有限公司)，乙腈(色譜純)；娃哈哈飲用純凈水；無水硫酸鈉、二氯甲烷和乙腈(分析純)；60~100目弗羅里硅土(150~250μm，650℃下烘烤3h，加5%蒸餾水脫活后使用)。

1.2檢測條件InertsilODS-SP色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相為V(乙腈):V(水)=60:40；流速0.6mL/min；檢測波長348nm；柱溫40℃；進樣量20μL。

1.3樣品的提取與凈化

1.3.1提取土壤樣品去掉砂石和植物殘體，研碎過20目篩(粒徑850nm)，四分法縮分留樣250g。柑橘全果、橘肉和橘皮分別切碎、勻漿，四分法縮分，留樣250g。分別準確稱取土壤、柑橘全果、橘肉和橘皮樣品各10g(精確至±0.1g)于250mL具塞三角瓶中，分別加入10mL蒸餾水和20mL二氯甲烷，靜置20min后超聲提取20min；將柑橘樣品提取液轉(zhuǎn)移至離心管中，于3600r/min下離心5min，取有機相10mL，于45℃下旋蒸濃縮至近干，待凈化。土壤樣品提取液用色譜純乙腈定容到2mL，過0.45μm有機濾膜，按1.2節(jié)條件測定。

1.3.2凈化參照文獻[24-25]并加以改進：分別將2mL分析純乙腈加入柑橘全果、橘肉和橘皮提取液并轉(zhuǎn)移至已制備好的弗羅里硅土層析柱(從下至上依次裝填有少許脫脂棉、2g無水硫酸鈉、5g弗羅里硅土、2g無水硫酸鈉)中；先用10mL分析純乙腈預(yù)淋洗，棄去淋洗液，再用40mL分析純乙腈少量多次洗脫，收集全部洗脫液，于45℃下旋蒸濃縮至近干，用色譜純乙腈定容到2mL，過0.45μm有機濾膜，按1.2節(jié)的條件測定。

1.4標準溶液的配制及標準曲線繪制準確稱取環(huán)氧蟲啶標準品0.025g(精確至±0.0001g)，用色譜純乙腈溶解并定容至50mL，配制成500mg/L的標準品母液，于4℃貯存，備用。試驗時再用色譜純乙腈梯度稀釋，配成質(zhì)量濃度分別為0.05、0.5、1、2和5mg/L的標準工作溶液，按1.2節(jié)條件測定。采用外標法定量。以進樣質(zhì)量濃度為橫坐標、相應(yīng)的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.5添加回收試驗在0.1、0.5和1mg/kg3個添加水平下，每個水平重復(fù)5次，按1.3節(jié)方法進行樣品前處理，按1.2節(jié)條件測定。

1.6田間試驗試驗于中國湖南長沙市進行。分別設(shè)推薦使用劑量和高劑量兩種施藥量，即按25%環(huán)氧蟲啶可濕性粉劑對水稀釋2000倍液(有效成分為125mg/kg)和1333倍液(有效成分為187.5mg/kg)，選擇從未施用過環(huán)氧蟲啶的地塊中樹齡為5a左右、長勢良好的柑橘樹進行試驗。對每小區(qū)柑橘樹噴霧施藥2~3次，以柑橘葉和果實有藥液開始滴落為度，施藥間隔期為10d，每處理重復(fù)3次。分別距最后一次施藥10、20和30d于每小區(qū)隨機選取10個點以上，采集0~15cm的土壤樣品約2kg，以及隨機按上、下、內(nèi)、外、向陽和背蔭方向采集柑橘樣品2kg，于–20℃貯存，備用。

2結(jié)果與討論

2.1方法的線性范圍及檢出限結(jié)果表明：在0.05~5mg/L范圍內(nèi)，線性方程為y=10243x+233.0(R2=0.9990)，表明環(huán)氧蟲啶質(zhì)量濃度與對應(yīng)的峰面積間呈良好的線性關(guān)系。環(huán)氧蟲啶在柑橘全果、橘肉、橘皮和土壤樣品中的最低檢測濃度均為0.1mg/kg。

2.2方法的準確度與精密度結(jié)果(表1和圖1)表明：在0.1、0.5和1mg/kg3個添加水平下，環(huán)氧蟲啶在土壤及柑橘中的平均回收率在76%~93%之間，相對標準偏差在1.6%~5.8%之間，均符合農(nóng)藥殘留分析方法的技術(shù)要求[26]。

2.3色譜條件的優(yōu)化由于環(huán)氧蟲啶標準溶液在348nm處有最大吸收峰，故選擇348nm作為檢測波長。分別以乙腈-水、甲醇-水不同比例作為流動相，綜合考慮環(huán)氧蟲啶的保留時間及峰形，最終確立以V(乙腈):V(水)=60:40為流動相，流速為0.6mL/min，柱溫40℃。環(huán)氧蟲啶標準溶液色譜圖見圖2。在此檢測條件下，以3倍信噪比計，儀器對環(huán)氧蟲啶的最小檢出量為1ng。由圖2可看出該方法對環(huán)氧蟲啶具有較好的分離效果。

2.4提取劑選擇和提取條件的優(yōu)化根據(jù)環(huán)氧蟲啶的極性與溶解性，分別考察了以二氯甲烷、丙酮、乙腈、二氯甲烷-水、二氯甲烷-氯化鈣為提取劑，同時分別采取超聲、水浴振蕩和恒溫振蕩等提取方式對比提取效果。結(jié)果表明：采用各單一提取劑均不能滿足農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)要求，其中二氯甲烷、丙酮和乙腈提取率分別為45.3%、47.8%和48.4%?？紤]到乙腈對實驗者的危害和成本較高等問題，丙酮提取色素較多對目標化合物的峰形干擾較大，故選擇二氯甲烷作為土壤樣品的提取劑，且添加10mL的蒸餾水后[21]，其回收率接近90%，故最終選取V(蒸餾水):V(二氯甲烷)=1:2為提取劑(表2)。此外，采用振蕩提取方式提取土壤樣品時，提取效果不理想，而采用超聲波提取卻獲得了較好的提取效果，故選擇超聲波提取。柑橘樣品采用了與土壤樣品相同的前處理方式，但因柑橘樣品中的共提雜質(zhì)較多，干擾目標化合物的峰形，因此需進一步凈化。

2.5凈化方法的優(yōu)化

2.5.1層析柱的選擇結(jié)果表明：采用中性氧化鋁層析柱凈化柑橘樣品時，雜質(zhì)與目標化合物均被吸附，未檢測到目標峰；而用弗羅里硅土柱凈化時，雜質(zhì)與環(huán)氧蟲啶分離效果好且回收率達100.2%，達到農(nóng)藥殘留檢測與分析的要求[26]。

2.5.2洗脫液體積的確定由圖3淋洗曲線可知：大部分環(huán)氧蟲啶集中在前40mL淋洗液中，回收率達到99%以上，從收集的第5個10mL淋洗液中僅檢測出極少量的環(huán)氧蟲啶，第6個10mL淋洗液中未檢出環(huán)氧蟲啶，綜合考慮，最終確定采用40mL洗脫。

2.6方法的應(yīng)用筆者采用本研究建立的分析方法，于2014年在中國湖南長沙進行了環(huán)氧蟲啶殘留的田間試驗。對采集于不同環(huán)氧蟲啶施藥劑量、不同施藥次數(shù)下柑橘果園里的柑橘和土壤樣品進行了環(huán)氧蟲啶殘留量檢測，結(jié)果(表3)表明該方法符合農(nóng)藥殘留檢測的要求[26]。

3結(jié)論

本研究建立了柑橘及土壤中環(huán)氧蟲啶殘留量的高效液相色譜檢測方法，樣品采用蒸餾水-二氯甲烷超聲提取；柑橘樣品經(jīng)弗羅里硅土層析柱凈化，HPLC-UVD測定；土壤樣品提取后無需凈化直接測定。該方法準確性好、精密度高，與陳敏[20]的土壤提取方法相比，具有操作簡便、省時、成本較低等優(yōu)點。本研究結(jié)果可為環(huán)氧蟲啶在柑橘作物上的安全性評價及在其他農(nóng)作物中的殘留檢測方法研究提供參考。

作者：聶紅英 楊仁斌 趙運林 吳育佳 歐陽文森 單位：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)環(huán)境保護研究所 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 杭州師范大學(xué) 生命環(huán)境與科學(xué)學(xué)院